肾素前体及其受体对人脐动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及其机制的研究

肾素前体及其受体对人脐动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及其机制的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-07 分类:参考文献 喜欢:2009
师大云端图书馆

【摘要】动脉粥样硬化以及由其引发的心脑血管疾病严重危害着人类的健康,关于动脉粥样硬化的发生机制,有多种学说包括脂质浸润学说,血栓形成学说,平滑肌细胞克隆学说及炎症损伤反应学说,目前最为认可的是ROSS提出的炎症损伤反应学说,他认为在各种刺激因素的作用下,首先动脉内膜损伤,内皮功能被破坏,继而分泌各种炎性因子,通过炎性因子的作用,平滑肌细胞表现出异常的多度增殖及凋亡不足,形成动脉粥样斑块从而引发各种心血管疾病。肾素-血管紧张素系统(Renin-AngiotensinSystem,RAS)作为人体的一个重要的调节系统,参与调节人体血压,水分及电解质以保持人体内环境的稳定。RAS的过度激活可导致多种心血管疾病的发生,例如高血压,动脉粥样硬化,心肌肥厚,心力衰竭等。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ,AngⅡ)是RAS的主要活性物质,AngⅡ与其受体结合后可发挥一系列促进增殖,促纤维化和促炎性反应,继而导致靶器官的损害,其在平滑肌细胞的增殖迁移及动脉粥样硬化的形成中发挥重要作用。肾素前体主要由肾脏分泌,并且在肾脏被激活转换为有活性的肾素。肾素前体本身一直被认为是没有活性的,但在上世纪80年代有报道显示在糖尿病患者中血浆肾素前体水平增多,随后的研究显示糖尿病患者中肾素前体的增多与微血管并发症有关联,并且早于微量白蛋白尿的出现,肾素前体水平连同糖化血红蛋白可以用来预测微量白蛋白尿的出现。这些足以说明肾素前体是具有功能的,提示机体可能处于一种病理状态,甚至可以作为预测某些疾病的一个指标。直到2002年Nguyen等提出有功能的肾素(前体)受体[(pro)reninreceptor,PRR],并证实了它存在于心脏、大脑、胎盘、肾脏和肝脏,发现肾素前体可与PRR在纳摩尔水平结合,除了通过传统的AngⅡ途径发挥作用,还可以不依赖于AngⅡ的方式发挥作用,激活信号通路,引起促纤维化促炎症等一系列反应,导致靶器官的损伤,这使人们对RAS有了新的认识。阻断RAS系统被认为具有心血管获益并能减低心血管疾病的风险,但却并不能完全抑制心血管疾病的发生,其原因可能存在其他机制导致心血管疾病的发生,肾素前体及PRR产生的独立于AngⅡ却类似于AngⅡ的作用可能为其中的一种机制。我们将以此为基础,研究肾素前体及PRR在不依赖于AngⅡ的作用下对人脐动脉平滑肌细胞增殖及凋亡蛋白表达的影响。动脉粥样硬化的发生发展被认为是一种慢性炎症过程,而炎症的一个重要标志就是活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的产生。氧化应激是一种ROS过量生成损害了细胞内抗氧化系统的病理状态。大量的研究证实,ROS的产生在心血管疾病的病理生理过程中发挥重要作用。由炎症细胞及血管壁上各型细胞产的ROS能引起细胞的增殖、凋亡、迁移及促炎性基因的表达增多,ROS引起的各型细胞的损伤及功能上的变化形成了动脉粥样硬化的病理基础。NADPH氧化酶系统是血管壁上ROS的主要来源,AngⅡ能够激活NADPH氧化酶生成ROS,进一步损伤内皮功能,加速降解NO,使内皮收缩功能降低,同时促进平滑肌细胞的表型的转换,引起异常的增殖迁移,基质蛋白生成增多。对于PRR作用的分子机制尚不完全明确,PRR能否像AngⅡ一样通过氧化应激引起平滑肌细胞发生各种促进动脉粥样硬化形成的改变?我们将以此为研究对象,研究肾素前体及PRR对人脐动脉平滑肌细胞(humanumbilicalarterysmoothmusclecells,HUASMCs)氧化应激的影响。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)是细胞内信号转导的重要蛋白酶,包括ERK、JNK、p38MAPK及ERK5四个亚族,其中细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases,ERK1/2)信号转导通路与细胞的增殖分化密切相关。各种刺激因素通过激活ERK1/2信号通路,使其磷酸化水平增多而发挥促进增殖作用,促炎性因子的表达等。研究证实AngⅡ可通过氧化应激产生ROS进一步激活ERK1/2信号通路,从而促进平滑肌细胞的增殖。因此,我们将以此为基础,探讨肾素前体及PRR能否通过激活HUASMCs中ERK1/2信号通路进一步影响细胞增殖作用,并探讨ERK1/2信号通路及其与氧化应激的关系。目的:观察PRR在人脐动脉平滑肌细胞中的分布,观察肾素前体及其受体对HUASMCs增殖的影响及对凋亡蛋白Bcl-2,Bax表达的影响,研究ROS产生和ERK1/2信号通路在其中的作用。方法:1.用免疫荧光法观察PRR在HUASMCs中的分布。2.在缬沙坦及PD123319阻断AngⅡ的作用下,分别以浓度为O.1nM,1nM,10nM的肾素前体干预HUASMCs24-48h,用CCK-8检测细胞的增殖水平。3.在缬沙坦及PD123319阻断AngⅡ的作用下,分别以浓度为0.1nM,1nM,10nM的肾素前体干预HUASMCs24h,各组用real-timePCR2及westernblot方法检测Bcl-2,Bax蛋白mRNA及蛋白表达水平。4.用siRNAPRR转染HUASMCs24,48及72小时后,用real-timePCR及westernblot方法检测PRR的mRNA及蛋白表达,确定转染效率最强时间点。5.用siRNA的方法使PRR表达下调后,再用缬沙坦及PD123319预处理30min后,以浓度为10nM的肾素前体干预HUASMCs24h,分别用CCK-8检测细胞的增殖水平,用real-timePCR及westernblot方法检测Bcl-2,Bax蛋白mRNA及蛋白表达水平。6.在缬沙坦及PD123319阻断AngⅡ的作用下,分别以浓度为0.1nM,1nM,10nM的肾素前体干预HUASMCs24h,然后收集细胞,在流式细胞仪上检测ROS水平。7.用siRNA的方法使PRR表达下调后,再用缬沙坦及PD123319预处理30min后,以浓度为10nM的肾素前体干预HUASMCs24h,在流式细胞仪上检测ROS水平。8.在缬沙坦及PD123319阻断AngⅡ的作用下,以浓度为10nM的肾素前体干预HUASMCs0-60min,用westernblot方法检测ERK1/2磷酸化水平。9.用DPI(NADPH氧化酶抑制剂)预处理HUASMCs30min后,再以浓度为10nM的肾素前体干预HUASMCs,用westernblot方法检测ERK1/2磷酸化水平。10.分别用PD98059(ERK1/2信号通路阻断剂)和DPI预处理HUASMCs30min后,再以浓度为10nM的肾素前体干预HUASMCs,用CCK-8检测细胞的增殖,用real-timePCR及westernblot方法检测Bcl-2,Bax蛋白mRNA及蛋白表达水平。结果:1.HUASMCs存在PRR的表达,细胞整个胞质中均有表达,在细胞核周围表达更明显。2.不同浓度肾素前体可在不依赖于AngⅡ的作用下促进HUASMCs的增殖,并且浓度在10nM时最强。3.用10nM浓度的肾素前体干预HUASMCs24-48h,随着时间延长,增殖作用明显增强。4.肾素前体可在不依赖于AngⅡ的作用下上调Bcl-2蛋白的表达,下调Bax蛋白的表达,抑制凋亡。5.siRNAPRR转染后,能减弱肾素前体引起的HUASMCs增殖作用,并且减弱肾素前体调节HUASMCs凋亡蛋白表达的作用。6.肾素前体在不依赖于AngⅡ的作用下,能够促进HUASMCsROS的生成,并且在肾素前体10nM浓度条件下的促增殖作用最明显,而siRNAPRR转染后能够减少肾素前体引起的HUASMCs中ROS的生成。7.肾素前体可在不依赖于AngⅡ的作用下将ERK1/2信号通路激活,并且磷酸化程度在15min-30min时作用最强。8.DPI及PD98059能抑制肾素前体引起的ERK1/2信号通路激活。9.DPI及PD98059可使肾素前体引起的HUASMCs的增殖作用明显减弱.10.DPI及PD98059可明显减弱肾素前体引起的HUASMCs的抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA及蛋白表达的上调作用。11.DPI及PD98059可明显减弱肾素前体引起的HUASMCs的促凋亡蛋白BaxmRNA及蛋白表达的下调作用。结论:1.PRR存在于HUASMCs中.2.肾素前体可通过PRR在不依赖于AngⅡ的作用下,促进HUASMCs的增殖,并上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调促凋亡蛋白Bax的表达。3.肾素前体可在不依赖于AngⅡ的作用下,促进HUASMCsROS产生增多,并且这种作用是通过PRR介导的。4.肾素前体可在不依赖于AngⅡ的作用下,激活HUASMCsERK1/2信号通路,并且这种作用通过ROS产生介导。5.阻断ROS产生和ERK1/2信号通路能减弱肾素前体及受体引起的HUASMCs的增殖作用,并且减弱对凋亡蛋白Bcl-2,Bax表达的调节作用。
【作者】刘峰伊;
【导师】姜一农;
【作者基本信息】大连医科大学,内科学,2014,博士
【关键词】肾素(前体)受体;人脐动脉平滑肌细胞;动脉粥样硬化;活性氧;ERK1/2信号通路;

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