苎麻谷氨酰胺合成酶基因的克隆和超量表达研究

苎麻谷氨酰胺合成酶基因的克隆和超量表达研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-02 分类:参考文献 喜欢:1796
师大云端图书馆

【摘要】氮素是植物生长发育所必需的矿质营养元素,直接影响着植物的生长和发育,决定着作物产量的高低和品质的优劣。谷氨酰胺合成酶(GS)作为高等植物氮代谢途径中氮素初始同化中的关键酶,是一切无机氮素进入高等植物体内的“门户”,影响着植物氮素营养的吸收、同化及利用效率,对作物的生长发育,及产量、品质等农艺性状具有决定性作用。高等植物中谷氨酰胺合成酶分为胞液型(GS1)和质体型(GS2)两类:GS2主要同化NO-3还原而来及光呼吸过程所释放的氨;GS1主要同化从土壤吸收的和由NO-3还原而来的氨,及再同化从植物体内各个氮循环途径所释放的氨。苎麻(BoehmerianiveaL.)作为古老的纤维作物,近年来因其叶片中蛋白质及必须氨基酸含量较高、嫩茎叶营养价值与苜蓿相近、营养结构合理、年生物产量大等,被作为植物蛋白饲料原料而大量利用;同时,苎麻具有植株生长速度快、对氮素需求量大等特点。但是,国内外与苎麻氮代谢及生长特性相关的研究几乎为零,也没有进行苎麻氮代谢途径中功能基因的发掘,相关功能的研究和利用,从而阻碍了研究者对苎麻饲用及生长特性在本质上的了解,同时,也不利于苎麻中优良功能基因的发掘和利用。因此,本文以植物氮代谢途径中关键基因GS为研究对象,首次从苎麻中克隆获得GS基因家族中的4个基因,并利用生物信息学对苎麻BnGS基因序列和结构进行了分析,利用实时荧光定量PCR技术,分析了苎麻GS基因在不同组织和发育阶段的表达模式,同时,利用ClustalW和MEGA软件对GS基因进行序列比对和系统进化分析;另一方面,本文利用同源重组技术,构建了苎麻BnGS1-2基因的超量植物表达载体,并利用农杆菌侵染烟草叶片,成功获得转基因烟草植株,同时,研究了超量表达苎麻BnGS1-2基因后,转基因烟草植株对氮素的同化和利用效率,为了解苎麻GS基因的功能,及利用苎麻BnGS基因改良植物氮素利用效率和农艺性状的研究提供新的基因资源。本文主要研究结果如下:(1)首次从苎麻栽培品种“中苎1号”中克隆获得苎麻GS基因家族中的4个基因,其中两个属于胞液型GS,命名为BnGS1-1和BnGS1-2;另外两个为质体型GS基因,命名为BnGS2-1和BnGS2-2,同时选取9株“中苎1号”自交后代,利用内切酶TaqⅠ酶切位点对两个质体型BnGS2基因进行TaqⅠ酶酶切鉴定,结果表明BnGS2-1和BnGS2-2为一对等位基因。(2)利用生物信息学对苎麻GS基因序列和结构特征进行分析,结果表明BnGS1-1基因序列全长1205bp,含一个1071bp的开放阅读框(ORF),编码356个氨基酸残基多肽;BnGS1-2基因序列全长1222bp,起始密码子位于第123-125bp,终止密码子位于1102-1104bp,编码356个氨基酸残基多肽;两个BnGS2等位基因序列全长1340bp,含一个1293bp的ORF区,编码430个氨基酸残基多肽;通过序列比对发现BnGS2等位基因ORF区11个位点核苷酸存在差异,导致编码的多肽在195、382两个位点上的氨基酸存在替换现象;苎麻BnGS基因家族编码的多肽序列含有beta-Grasp和catalytic两个保守功能域,均属于Gln-synt结构域,同时,BnGS2基因编码的多肽序列含有一段信号肽;所克隆的苎麻BnGS基因家族编码的多肽序列在56、92、249和297位点上的氨基酸残基分别为天冬氨酸、半胱氨酸、组氨酸和谷氨酸,苎麻BnGS2等位基因在306和371两个位点上都为半胱氨酸残基。(3)利用EMBOSS和MEGA软件对苎麻BnGS基因家族进行序列比对和系统进化分析,发现苎麻BnGS基因在蛋白质序列上的相似性为77.25-91.57%,在核苷酸序列上的相似性为71.15-79.37%,并且BnGS1两个基因之内要比BnGS1与BnGS2之间的相似性高。通过对苎麻和其它物种GS基因系统进化分析表明,BnGS1-2基因在进化上起源于双子叶植物,而BnGS1-1基因却被聚类在单子叶植物分支上,同时,苎麻BnGS1-2和BnGS2与苜蓿(Medicagosativa),大豆(Glycinemax)和豌豆(Phaseolusvulgaris)等具有较近的亲缘关系。(4)利用实时荧光定量PCR分析苎麻BnGS基因在不同部位和发育阶段的表达模式,结果表明BnGS1-1、BnGS1-2和BnGS2在苎麻叶片、茎、根、韧皮部及木质部中都有表达,但在不同的部位不同的BnGS基因的表达水平却呈现明显的差异。BnGS2基因主要的表达部位为叶片,同时,随着发育阶段的不同,相对表达量也呈现明显的不一样,表达量最高的时期为出苗期和纤维发育期;BnGS1-1基因在叶子、根和韧皮部中的相对表达量明显比茎及木质部高,但是在成熟阶段叶片中BnGS1-1的mRNA水平呈显著下降;韧皮部、木质部和茎中的BnGS1-2基因,在纤维发育时期被大量的诱导,表明苎麻BnGS1-2基因可能在纤维的发育过程中起着关键的作用。另一方面,BnGS1-1和BnGS1-2基因在苎麻整个生长过程中,在根部的表达量都呈现较高的水平。因此,苎麻不同的BnGS基因通过在特定部位表达量水平的调节,从而调控苎麻生长发育过程中对氮素营养的需要。(5)本文利用同源重组技术将苎麻BnGS1-2基因转入pBI121植物表达载体特定位点,构建了能超量表达BnGS1-2基因的植物表达载体。在农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404的介导下,通过叶盘法将构建的超量表达载体转入烟草中。通过Kana筛选和基因组DNAPCR验证,获得转基因烟草植株。利用Q-PCR对转基因植株T1进行分析,结果显示BnGS1-2在转基因植株中检测到表达,转基因烟草中GS酶活性是野生型的1-2倍。超量表达BnGS1-2基因能显著增加转基因烟草植株的株高、鲜重和叶面积,因此,超量表达BnGS1-2基因能促进烟草植株的生长;另一方面,转基因植株体内水溶性蛋白与野生型烟草相比呈现极显著性升高,增长率达92.02%,总氮含量有所提高,但并没有达到显著性水平,同时,转基因植株体内游离NH+4含量显著下降,而游离NO-3含量与野生型相一致,因此,超量表达BnGS1-2基因,能够促进转基因烟草植株对氮素的吸收和利用,提高氮代谢效率,从而能够保证植株快速生长对氮素营养的需求。总之,本研究为苎麻GS基因功能的研究和应用提供一个理论和物质基础。
【作者】郑建树;
【导师】熊和平;
【作者基本信息】中国农业科学院,作物遗传育种,2014,博士
【关键词】苎麻;GS基因克隆;表达模式;转基因;超量表达;氮代谢;

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