IBV，NDV，AIV H9感染鸡气管比较蛋白质组分析及鸡galectin CG-1B在NDV感染中作用机制的研究

【摘要】新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV），传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus，IBV）以及禽流感病毒H9亚型（Avianinfluenzavirus，AIV）是在世界范围内引起家禽发病和死亡的主要病因，能够引起急性、高度传染性的禽呼吸道疾病，对养禽业造成巨大的经济损失。鸡气管上皮细胞不仅是禽呼吸道病毒感染和复制的靶细胞，同样也是宿主先天免疫的第一道防线。IBV，NDV和AIVH9能够感染气管上皮细胞引起气管上皮的损伤从而导致呼吸道疾病，然而这三种病毒感染引起的疾病严重程度和疾病预后并不相同。为研究IBV，NDV和AIVH9致病性的分子基础以及病毒与宿主特异性相互作用，本研究应用2D-DIGE结合MALDI-TOF/TOFMS的比较蛋白质组学方法对IBV，NDV和AIVH9感染后靶器官（气管）的蛋白质组变化进行了分析。在IBV（ck/CH/LDL/97I，H120），NDV（LaSota），AIVH9感染的鸡气管组织中分别有44，39，41，48种蛋白的表达发生了显著地变化；在IBV不同毒株ck/CH/LDL/97I和H120感染的鸡气管组织中，鉴定到了38种表达存在差异的蛋白。利用RealtimeRT-PCR对存在差异的EIF5A2，GNB2L1，PRDX1，PRDX3，SOD1，LGALS1，ANXA2，ANXA1，ERP29和HSPB1进行了转录水平分析，结果表明这些差异表达蛋白的mRNA变化趋势与2D-DIGE中相应蛋白的变化趋势一致。Westernblot分析进一步验证了ANXA1，ANXA2，PRDX1和HSPB1的表达变化，结果与2D-DIGE一致。此外，2D-DIGE分析中发现，多个具有相似分子量、不同等电点的蛋白点均鉴定为HSPB1，提示IBV，NDV和AIVH9感染可能引起HSPB1发生磷酸化修饰。因此，我们利用针对磷酸化HSPB1的特异性抗体进行Westernblot分析，结果显示IBV（ck/CH/LDL/97I，H120），NDV（LaSota）和AIVH9感染能够引起气管中磷酸化HSPB1的表达上调。生物信息学分析显示IBV，NDV和AIVH9感染对宿主细胞整体的影响是相似的，差异表达蛋白参与的生物学过程均主要包括生物合成，分解代谢，信号转导，运输，细胞骨架组织，大分子复合体组装，细胞死亡，应激反应和免疫系统进程。对三种病毒引起的宿主反应进行比较发现：IBV，NDV和AIVH9引起的蛋白表达变化的差异可能与这三种病毒特异性的致病机制有关。本研究通过选择相同病毒的不同毒株（IBV强毒株ck/CH/LDL/97I和疫苗株H120），以及不同的病毒（IBV，NDV和AIVH9）进行比较分析，为阐明不同病毒特异性的分子致病机制以及病毒宿主相互作用提供信息，并为针对IBV，NDV和AIVH9设计新型的预防和治疗策略提供线索。比较蛋白质组学分析发现，鸡气管组织中β-半乳糖凝集素（chickenbeta-galactoside-bindinglectin，CG-1B）在NDV感染后表达量升高。哺乳动物的β-半乳糖凝集素能够与囊膜病毒表面的糖蛋白结合从而促进或者抑制病毒的吸附和感染，但是禽类的β-半乳糖凝集素在病毒感染中的潜在作用尚未见报道。为探索CG-1B在NDV感染中的作用机制，本研究体外表达纯化了鸡的β-半乳糖凝集素（CG-1B），通过红细胞凝集试验证明了CG-1B能够抑制NDV的血凝活性。建立捕获ELISA方法检测CG-1B与NDV病毒粒子的直接结合，结果显示CG-1B能够与NDV以剂量依赖性的方式结合。为了鉴定与CG-1B相互作用的NDV蛋白，本试验构建了CG-1B微量亲和色谱并通过免疫共沉淀的方法筛选与CG-1B结合的NDV蛋白，结果发现CG-1B与NDV中约70kD的蛋白存在相互作用，经液相色谱串联质谱鉴定为NDV的HN蛋白。体外细胞感染试验证明，CG-1B能够显著的抑制NDV吸附感染细胞，而且转染编码CG-1B表达载体的细胞中所产生的病毒滴度低于空载体转染的细胞。激光共聚焦试验证实CG-1B与NDVHN蛋白在细胞中能够共定位于细胞质和细胞膜附近。本研究首次证明了CG-1B蛋白能够与NDV的HN蛋白相互作用从而抑制NDV吸附感染细胞，并能够抑制细胞中NDV的增殖，表明CG-1B具有抗NDV作用。这些结果为进一步研究NDV的致病机制和病毒宿主之间的相互作用奠定了基础。
【作者】孙军峰；
【导师】刘胜旺；
【作者基本信息】中国农业科学院，预防兽医学，2014，博士
【关键词】新城疫病毒；传染性支气管炎病毒；禽流感病毒H9亚型；蛋白质组学；致病机制；鸡β-半乳糖凝集素；

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