大丽轮枝菌毒力基因的筛选与功能鉴定

【摘要】大丽轮枝菌属子囊真菌可导致600多种双子叶植物引发黄萎病,对农业生产连年造成重大经济损失,其中包括多种重要经济作物如棉花,橄榄,番茄,草莓等。目前人们对大丽轮枝菌的致病机理了解甚少,而筛选和鉴定大丽轮枝菌关键致病因子是揭示大丽轮枝菌致病分子机理的重要前提。随着基因组和蛋白组研究新技术的快速发展,为高效系统的筛选和鉴定大丽轮枝菌致病相关基因提供了有利条件。本研究基于大丽轮枝菌基因组数据,选择了坏死及乙烯诱导蛋白（NEP）家族为大丽轮枝菌候选致病相关的基因进行深入的功能研究。从VdG1菌株基因组中获得NEP家族的8个基因VdNEP1至VdNEP8.其中VdNEP6基因编码256个氨基酸,包含一个保守基序GHRHDWE,研究认为含有该保守序列的基因可影响植物细胞质膜的通透性,并能触发植物细胞的防卫反应从而诱导细胞坏死反应。VdNEP6基因在20株不同棉产区收集到的大丽轮枝菌菌株中具有较多的非同义SNP突变,该基因在不同菌株中较高的变异性表明其可能与大丽轮枝菌致病毒力相关。同时信号肽活性检测实验表明VdNEP6为胞外分泌蛋白。但是VdNEp6基因敲除突变株的致病力及生长表型与野生型菌株VdG1均无明显差异。利用PVX载体PGR107通过农杆菌介导的VdNEP6在烟草中的瞬时转化实验结果表明该基因不能够诱导植物细胞的坏死反应。实验结果表明VdNEP6基因不能够引发植物细胞的坏死反应且与大丽轮枝菌致病力没有直接相关性。基于前期大丽轮枝菌比较分泌蛋白组数据,获得了大量高效应答棉花组织的糖基水解酶家族蛋白,表明该类蛋白与大丽轮枝菌致病力具有潜在的相关性。本研究挑选了10个在棉花组织培养条件下高效诱导表达的CAZy基因,并对其毒力功能进行了初步的鉴定。对10个CAZy基因进行了全长克隆,并利用PVX介导的烟草瞬时表达系统检测了10个基因的细胞诱导坏死及抑制坏死效应。结果显示这些基因均不能够诱导烟草叶片细胞的坏死反应,然而其中的两个基因（VDG10.3897和VDG10.3197）,分别预测为角质酶和羟肽酶Y,能够有效的抑制细胞凋亡调节蛋白BAX及VdNEP1激发子蛋白所诱导的细胞死亡。该实验结果表明两个候选基因可能通过调节寄主的免疫反应从而增强病原菌的致病力。基因表达分析显示两个候选基因在棉花组织诱导培养基中能够被强烈的诱导表达,说明了其在参与大丽轮枝菌侵染过程中可能发挥的作用,值得进一步深入研究。此外,为了揭示大丽轮枝菌特异定殖于植物维管束组织机理,通过比较基因组学对14种已经测序的植物病原真菌（维管束和非维管束病害真菌）基因组数据进行了比较分析。参试的真菌分为三组,分别为粪壳菌（Fusariumgraminearum,F.oxysporum,Verticiliumdahliae,V.albo-atrum,Neurosporacrassa,MagnaporthegriseaandChaetomiumglobosum）,散囊菌（AspergillusnidulansandA.terreus）和榷舌菌（Botrytiscinerea）。大规模序列比对分析结果显示有57个基因特异存在于大丽轮枝菌中。将57个基因在已报道的135个真菌基因组中进行深入的比对分析发现,有5个基因高度特异的存在于典型植物维管束病害真菌中,如大丽轮枝菌（V.dahliae）,尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）及黑白轮枝菌（V.albo-atrum）。这5个基因被分别命名为VdVSl,VdVS2,VdVS3,VdVS4,VdVS5。基因表达分析表明,在大丽轮枝菌侵染棉花过程中,5个维管束相关基因能够被显著地诱导表达。其中将野生型菌株VDGh1.991中VdVS3和VdVS5敲除后并不影响菌落的生长状况及孢子的产生,但与野生型相比这两个基因的突变株的致病力显著下降,表明VdVS3和VdVS5在大丽轮枝菌侵染寄主过程中发挥重要作用。因此对VdVS3和VdVSS基因功能的进一步研究对于揭示大丽轮枝菌及维管束病害真菌的致病机理具有重要的意义。综上所述,该研究发现了一些与大丽轮枝菌致病相关的靶标基因,进一步的基因功能鉴定将会大大增进大丽轮枝菌和维管束真菌病害致病机理的研究。
【作者】SamiMohammedAdamMohammed；
【导师】戴小枫；
【作者基本信息】中国农业科学院，植物病理学，2014，博士
【关键词】大丽轮枝菌；致病性；坏死及乙烯诱导蛋白；CAZys；维管束相关基因；

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