地衣芽胞杆菌木糖利用代谢工程

【摘要】当前社会发展面临的能源和粮食危机使得人类对开发利用纤维素生物质资源寄予厚望,在发酵工业中以木质纤维素或其降解物作为发酵原料降低发酵成本解决资源危机已成共识。木糖是木质纤维素中含量仅次于葡萄糖的单糖,但很多微生物代谢木糖能力不强,且在以葡萄糖和木糖等混合碳源发酵时,CCR效应会抑制木糖的摄入利用。本研究旨在以本实验室保藏的地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)WX-02为出发菌株,构建能高效稳定利用木糖的工程菌株。为解除该菌株的CCR效应使菌株能同时高效利用葡萄糖和木糖发酵,敲除基因ccpA得到缺失菌株WX-02△ccpA,考察在乙偶姻发酵培养基下缺失菌株与野生菌株的生长状况及乙偶姻的产量,发现缺失菌株的生长严重受阻。已有报道表明细菌中受CRR效应调控的基因数量庞大,可能该基因缺失干扰了与菌株生长代谢极其重要的基因的表达,因此通过此方式解除CCR效应是不合适的。进而考虑在野生菌株中敲除PTS系统中的ptsG和ptsH基因,得到缺失菌株WX-02△ptsGH,使菌株不能产生CcpA的结合蛋白HPr,从而间接导致CcpA不能发挥作用。同样在乙偶姻发酵培养基中考察该菌株的特性,缺失菌株生长不受影响,且在只有葡萄糖情况下不影响菌株对葡萄糖的摄入利用,乙偶姻、丁二醇的产量也无显著性差异；进而在以60g/L葡糖糖和30g/L木糖为底物的乙偶姻发酵培养基中检测上述指标,结果表明葡萄糖都能在16h时耗完,木糖消耗水平和乙偶姻、丁醇产量都无显著性差异。这两方面数据显示ptsGH的缺失对CCR效应的解除未达到预期效果。以上尝试解除CCR效应的策略都未起到预期的效果,则试图通过增强木糖特异性转运实现预期目的,超表达B.subtilis来源的木糖转运蛋白AraE,得到工程菌株WX-02pHYaraE,同样在以60g/L葡糖糖和30g/L木糖为底物的乙偶姻发酵培养基中检测上述指标,结果表明工程菌株的木糖利用水平并未增强。据此情况,选择增强木糖代谢途径中的关键酶来作进一步探究,在WX-02基础上超表达其自身的木糖异构酶Xy1A,木酮糖激酶Xy1B,得到工程菌株WX-02pT49xyl4,WX-02pT49xylB,在同上培养基和培养条件下检测菌株生长状况及木糖消耗水平,发现木糖消耗水平并未得到提升,且因为转入质粒载体的原因,工程菌株的生长状况比野生型菌株稍弱。另外,本研究还尝试通过对xylAB操纵子的去调控,如敲除该操纵子阻遏蛋白Xy1R编码基因xylR,以及用组成型启动子P43替换木糖异构酶基因xylA的可受CcpA蛋白抑制的诱导性启动子,但都未起到预期效果。综上所述,本研究中的改造策略都未取得理想效果,更多关于B.licheniformis的木糖代谢特点有待深入探究。
【作者】袁润；
【导师】陈守文；
【作者基本信息】华中农业大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】地衣芽胞杆菌；木糖利用；ccpA；PTS；araE；xylA；xylB；

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