绿豆萌发的动态代谢组学研究

【摘要】种子萌发是指种子从吸涨到胚根突破种皮或胚乳的过程。它一直是植物生理的研究热点之一：一方面,人类1/2的粮食供应来源于农作物的种子,种子萌发与否与粮食产量息息相关；另一方面,萌发对植物种质资源的保存和植物种族的延续有重大意义。为定量研究(1)黑暗条件下,种子萌发过程中代谢物的变化规律；(2)后熟作用对后熟期较短的种子萌发过程的影响,本论文以绿豆(Vihnaradiata)为材料,以基于核磁共振(NMR)和反相高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱检测器联用(RPLC-DAD-MS)技术的代谢组学为方法,从以下三个方面进行了探索。第一,本论文优化了基于NMR的植物代谢组水相提取和定量方法,结果显示：(1)在本论文使用的六种提取溶剂中,50%甲醇更适合植物代谢组水相提取；(2)经液氮研磨后,组织破碎和超声破碎的结合运用能更加有效地破碎植物细胞,但操作过程中必须严格控制温度和时间；(3)为充分提取植物组织代谢组的水相成分,至少要以1：10至1：15(mg:μL)间的原材料重量和提取溶剂体积之比提取三次；(4)进行NMR检测时,提取物浓度在6.7mg·mL-1左右比较合适；(5)相对于利用T1弛豫时间定量,全弛豫谱定量更加准确可靠。第二,本论文建立了一种简便有效的、基于RPLC-DAD-MS的分离和定量莽草酸代谢途径介导的26种芳香族羧酸的方法,并且详细总结了它们的质谱裂解规律、紫外最大吸收波长和摩尔吸光系数等信息,结果表明：(1)柱后合理添加有机试剂(例如乙腈)可以降低质谱信号的半峰宽、增强信号的灵敏度,并且这种影响与化合物极性在一定时间内负相关；(2)利用该方法定量,线性良好,灵敏度、精确度和准确度高；(3)利用该方法,本论文在褐飞虱感染水稻及其对照组的茎提取物中检测了12种与莽草酸代谢相关的羧酸,并对其中8种代谢物进行了定量。它们的含量变化与由文献推导的结果一致,这证明了该方法在实际应用中的可行性。第三,本论文研究了黑暗条件下,新鲜及后熟绿豆(EluuNo.4)萌发过程中的代谢组变化规律。(1)新鲜绿豆萌发过程中发生了如下变化：(A)种皮颜色逐渐变浅；绿豆在吸涨6小时时开始萌发；至18小时萌发完成时,萌发率高达90%以上,绿豆含水量高达65%左右,千粒湿重达到干种子重量的2.5倍左右,但绿豆干重仅发生了微小变化。(B)绿豆萌发共分为吸涨准备期(第一阶段,0至3小时,吸涨缓慢)、萌发前期(第二阶段,3至9小时,吸涨速率加快)、萌发中期(第三阶段,9至14小时,吸涨速率减缓)、萌发准备期(第四阶段,14至16小时,吸涨速率加快)和后萌发期(第五阶段,16小时以后,胚根生长期,吸涨速率加快)等五个阶段。在吸涨准备期,细胞内仅少量代谢物含量改变。在萌发前期,绿豆细胞内与无氧呼吸相关的代谢物—乳酸、乙醇、丙氨酸和γ-氨基丁酸含量上升；与抗氧化代谢相关的酒石酸的含量则显著下降；与电子传递链相关的烟酸类代谢物,与糖类代谢相关的化合物—蔗糖、单糖、棉籽糖家族寡糖,与莽草酸代谢相关的羧酸和氨基酸等化合物含量均发生了显著性的改变,而棉籽糖家族寡糖的降解是绿豆萌发最主要的能量来源；在此阶段,绿豆细胞内发生了核酸的合成,表现为尿苷含量的下降以及单磷酸尿苷和单磷酸胞苷含量的升高；吸涨导致了绿豆提取物和培养基中与渗透压调节相关的代谢物—肌醇类和胆碱类化合物的含量发生了明显变化。在萌发中期,绿豆提取物中发生变化的代谢物种类减少,但是糖酵解和TCA循环代谢仍然持续；细胞对培养基中的小分子化合物进行重吸收；此过程中还发生了RNA和嘌呤的合成,表现为单磷酸胞苷含量的降低和单磷酸尿苷、单磷酸次黄嘌呤含量的升高。在萌发准备期,吸涨速率的加快导致细胞壁通透性再次增加,细胞内代谢物再次进入培养基,以维持渗透压平衡。在后萌发期,绿豆细胞第二次重吸收培养基中的小分子代谢物,为细胞分裂和营养物质的合成作准备；绿豆提取物中与糖类、氨基酸、胆碱、三羧酸循环和尿嘧啶含量均发生了显著变化。(C)新鲜绿豆萌发时,尿烷、天冬氨酸、丫-氨基丁酸、丙氨酸、色氨酸、2-氨基-4-氧戊酸等代谢物发挥了重要作用；而且此过程中可能涉及乙醇酸代谢途径。(2)与新鲜绿豆相比,不萌发绿豆有如下变化：(A)不萌发种子培养基中代谢物种类更少,变化速率更加缓慢。(B)棉籽糖类寡糖的降解受阻,核苷酸、胆碱、氨基酸、TCA循环和莽草酸途径代谢紊乱,并且不萌发种子不能及时代谢甲酸。(3)虽然绿豆后熟期较短,但是后熟作用仍然对其萌发产生了显著影响：(A)后熟作用促使绿豆萌发进程加快,使其萌发率在吸涨16小时时已接近最大值；后熟作用使种子代谢更加同步化,从而使后熟绿豆萌发率、含水量和千粒重的标准偏差更小。(B)后熟作用导致绿豆干种子内尿烷、O-甲基鲨肌醇、磷酸胆碱、胆碱、N1-甲基烟酸、尿嘧啶、肌苷、天冬氨酸和甲硫氨酸等代谢物含量发生了显著性变化。(C)后熟绿豆萌发时各代谢物含量变化趋势与新鲜种子相似,但是与新鲜种子相比,其种子提取物和培养基中代谢物变化速率更加迅速；后熟绿豆细胞内有氧呼吸高于新鲜绿豆,而无氧呼吸低于新鲜绿豆。
【作者】吴香玉；
【导师】唐惠儒；
【作者基本信息】中国科学院研究生院（武汉物理与数学研究所），分析化学，2014，博士
【关键词】萌发；后熟作用；定量代谢组学；NMR；RPLC-DAD-MS；

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