应用脉冲电场刺激构建组织工程学血管材料的实验研究

【摘要】血管疾病发病率有逐年增高的趋势,而血管移植手术仍是临床治疗这类疾病的最常用手段之一。目前临床常用人工血管有Dacron和ePTFE等,由于顺应性较差,血管表面没有内皮细胞覆盖,内膜过度增生,易形成血栓等原因,在小口径小血管(<5mm)移植时,长期通畅率低,是血管外科领域有待解决的难题。近年来,血管组织工程学方面的研究为解决上述难题提供了新的途径。组织工程血管有两方面关键内容：仿生学细胞外基质支架的构建和种子细胞的种植方法。电纺丝技术可以模拟天然细胞外基质形态结构构建纳米纤维支架,且技术成熟,应用越来越广。外周血内皮祖细胞取材方便,具有强大的增殖潜能,具有稳定的表型和功能,是组织工程血管理想的种子细胞。目前在种子细胞的种植技术领域已有许多研究,但存在细胞粘附率低、技术复杂、耗时长等缺点。生物电场作用广泛存在于血管组织的发育和修复,研究发现人造电场可以诱导内皮细胞的血管生成反应,影响细胞形状、运动和组织结构,引起明显的细胞延伸和定向迁移。本研究经兔外周血分离获取内皮祖细胞作为种子细胞,使用电纺丝技术制备聚己内酯纳米纤维血管支架,通过研制的反应器,利用脉冲电场刺激诱导方法,将内皮祖细胞和聚己内酯纳米纤维血管支架复合培养构建成组织工程血管补片,再移植到兔颈动脉和股动脉进行动物实验,评估其各项性能,尝试创建一种全新、高效的组织工程材料种子细胞种植方法。全文分为四个部分：第一部分外周血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定目的：建立由外周血分离内皮祖细胞(EPCs)的方法,并进行体外培养和鉴定,选择合适的EPCs作为种子细胞用于体外构建组织工程补片。方法：经兔心脏穿刺获取外周血,使用密度梯度离心法,淋巴分离液分离外周血,得到外周血单核细胞悬液,采用EGM-2培养液置于预先铺板Fn的培养瓶中,在体外进行诱导培养获取人和兔内皮祖细胞。对其生长增殖、细胞表型、蛋白表达、形成血管能力、分泌生长因子情况和一氧化氮释放进行鉴定,以确认内皮祖细胞适用于用于构建组织工程血管补片。结果：内皮祖细胞可来源于单核细胞。EGM-2培养基培养贴壁单核细胞10-14天后,细胞呈集落状生长,在培养的2-3周后出现大量生长迅速的卵圆形外观细胞。其具有强大的增殖能力,细胞表型类似于内皮细胞,能摄取Dil-ad-LDL和UEA-I。CD31、CD34和VEGFR-2内皮细胞表面抗原标记强阳性,但不表达CD133。内皮祖细胞可在Matrigel上形成毛细血管网状结构。此外,内皮祖细胞还可以释放一氧化氮。结论：密度梯度离心法结合贴壁分离培养法,可以有效分离外周血单核细胞,有效分离和纯化外周血来源的EPCs,分离培养的细胞具有内皮祖细胞的基本表型和特征,且体外增殖活跃。可以用来构建组织工程血管补片。第二部分聚己内酯纤维组织工程血管支架的制备和其性能研究目的：应用电纺丝技术制备聚己内酯纳米纤维组织工程血管支架,为构建组织工程血管提供理想的支架材料。方法：按质量比为7：3分别准确称取PCL和PEO,将两者溶于氯仿中配置均匀纺丝液。应用电纺丝技术构建膜状聚己内酯纳米纤维组织工程血管支架。通过倒置显微镜及扫描电镜研究此支架结构及形态,并对其力学性能、亲水性等性能进行研究。为了检测此组织工程血管支架的生物相容性,将内皮祖细胞种植于支架表面,研究了细胞在支架上分布、粘附、生长、增殖及功能情况。结果：应用电纺丝技术成功构建了聚己内酯纳米纤维支架,其纳米纤维直径平均约700±35mm,呈无序排列,具有与天然血管类似的结构。聚己内酯纳米纤维支架具有优秀的生物力学性能,其缝合撕裂强度为(4.4±0.6),超过天然动脉和脱细胞支架；通过计算细胞粘附率、MTT法及一氧化氮释放分析结果表明聚己内酯支架与内皮祖细胞有生物相容性良好。结论：聚己内酯纳米纤维具有优异的生物力学性能和良好的生物相容性,表明其可作为组织工程血管支架材料用于进一步研究。第三部分应用脉冲电场刺激构建组织工程血管材料的实验研究目的：探讨应用脉冲电场刺激构建内皮祖细胞复合聚己内酯纳米纤维支架组织工程血管的可行性。方法：应用第一部分方法构建组织工程血管膜状支架备用,同时尝试构建具良好导电性的大面积柔性自支撑聚苯胺纳米结构薄膜也用于此实验。将两种支架置于自制的脉冲电场刺激器中,消毒备用。使用培养的第3代的兔内皮祖细胞胰酶消化,CM-DiI标记后制成细胞悬液,将细胞悬液加入反应器孔中,之后打开电刺激器,按照电场强度(OV,1V/cm,2V/cm,4V/cm)和刺激时间(1h和2h)的反应条件将其分为多组。2小时后,取出复合有内皮祖细胞的支架,行光镜、电镜观察和比较在不同电场刺激条件下,内皮祖细胞在聚己内酯纳米纤维管状支架和聚苯胺纳米结构薄膜上的粘附、生长及分布情况；荧光显微镜下观查CM-DiI染色阳性细胞的粘附及生长情况。使用MTT法和NO试剂盒测定脉冲电场刺激对细胞活力及细胞功能等影响。同时利用生物力学测定仪检测电场刺激培养后组织工程血管补片的力学性能。结果：在脉冲电场刺激下培养后,内皮祖细胞与组织工程支架构建结合。组织学、电子显微镜分析表明,适合的电场强度是2V/cm,在此条件下细胞在支架表面粘附最多,形态最好,连接最为紧密,2小时即可形成完整稳定的内皮单层。但是4V/cm的电场强度不利于细胞的粘附和生长,反而对细胞有害。电刺激培养后,聚乙内酯纳米纤维补片保持了良好的力学性能。荧光染色分析也证实晚期内皮祖细胞与支架材料结合紧密,生长良好。MTT和NO测试也显示2V/cm的电场强度不影响细胞活力,同时可能有助于增强内皮细胞功能。聚苯胺纳米结构薄膜由于电导率良好,更有利于电场下细胞在支架表面的粘附,但是其物理性质脆弱。结论：应用脉冲电场刺激体外培养构建组织工程血管补片,可明显促进细胞在支架表面的粘附,缩短构建时间,对细胞活性及功能无不利影响。成功于体外在脉冲电场刺激下构建了兔外周血内皮祖细胞复合聚己内酯纳米纤维支架组织工程血管补片。第四部分组织工程血管补片动物体内移植实验研究目的：建立兔颈动脉和股动脉血管补片模型,观察经体外脉冲电场刺激构建的组织工程血管补片在移植后短期的组织形态学变化、内皮细胞覆盖情况及通畅率情况。方法：于体外在脉冲电场刺激下将CM-DiI标记的兔内皮祖细胞与聚己内酯纳米纤维支架复合体外构建成组织工程血管补片。以新西兰大白兔为研究对象,将构建的组织工程血管补片移植于兔颈动脉和股动脉,并将静态种植组和脱细胞组作为对照。移植后每周使用多普勒超声随访检查,观察对比组织工程血管补片在动物体内通畅率及管腔结构变化。移植后3周,取出移植段动脉标本,行大体观察,HE染色,在光镜和扫描电镜下观察组织工程血管结构变化及内皮化情况。应用荧光显微镜观察CM-DiI和FITC-vWF荧光染色阳性细胞来检测补片管腔内壁内皮化情况及内皮细胞来源。同时,对移植后组织工程血管的生物力学性能变化情况也进行了检测。结果：移植后,所有静态培养的血管补片在3周内均发生了血管闭塞(0/7),后经解剖证实为血栓形成。脉冲电场刺激构建的血管补片,仅有1例在3周内发生了血管闭塞(6/7),余下血管在3周过程中均保持通畅,形态结构无明显退行性变。脱细胞血管补片2例发生感染,2例在三周内发生闭塞(3/7)。电场刺激组短期内通畅率最高,为85.6%(6/7)。3周后取出组织工程血管补片,通畅的组织工程血管补片结构完整,无狭窄及血栓形成。而在闭塞的血管中,血栓形成明显可见。HE染色显示通畅的组织工程血管补片与周围组织相融合,结构完整,内壁覆盖有内皮细胞；扫描电镜也证实组织工程血管补片内壁已完成内皮化过程。荧光染色分析示,补片内壁存在CM-DiI和FITC-vWF荧光双染色细胞,表明种植内皮祖细胞可分化为内皮细胞参与内皮化过程。此外生物力学性能检测发现补片的机械性能略有降低。结论：本研究构建的组织工程血管补片在动物体内移植后,具有良好的生物相容性,近期通畅率高。本研究方法可提高种子细胞的种植效率,加快内皮化过程,可能为构建组织工程血管提供一种高效的新技术。
【作者】刘昭；
【导师】丁义涛；
【作者基本信息】南京大学，外科学，2011，博士
【关键词】组织工程；内皮祖细胞；血管支架；聚己内酯；电纺丝；生物反应器；脉冲电场；补片移植；生物相容性；

【参考文献】
[1]崔红霞.情景教学法在高中英语语法教学中的应用[D].首都师范大学,学科教学,2013,硕士.
[2]高華娟.《毛詩正義》注釋研究[D].西南大学,漢語言文字學,2013,硕士.
[3]魏发孔,周厚金,王宏武.曳引式灯光吊挂机械装置的研究与设计[J].演艺设备与科技.2004(02)
[4]韩锐.基于SolidWorks的机构运动仿真研究[D].西安理工大学,机械设计及理论,2004,硕士.
[5]周德开.气泡驱动纳米马达制备及运动控制方法研究[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2013,硕士.
[6]张飞,陈卫东,席裕庚.多机器人协作探索的改进市场法[J].控制与决策,2005,05:516-520+524.
[7]敬姣.对外汉语成语教学中的文化因素研究[D].湖南师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[8]张娴静.张艺谋“印象系列”的修辞学分析[D].福建师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[9]王远胜.美国对外关系委员会对我国民间高层智库建设的启示[D].湖北大学,行政管理,2012,硕士.
[10]刘琳,张东.石墨烯/聚合物导电复合材料的研究[J].功能材料,2014,S1:7-11.
[11]娄永录.地铁线路设计中几个技术问题的分析与探讨[J].城市轨道交通研究.2003(05)
[12]杨致荣.调控长春花生物碱合成的WRKY转录因子鉴定及功能分析[D].山西农业大学,作物遗传育种,2013,博士.
[13]刘晓晨.90后大学生精神需求及其引导[D].长安大学,思想政治教育,2014,硕士.
[14]潘祺,朱东华,汪雪锋,袁军鹏.技术监测在科研管理中的应用—纳米技术监测[J].科学学研究,2005,01:82-86.
[15]张娜.新时期供销合作社职能转型研究[D].东北师范大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[16]苗频新.一种基于本体的SOA设计模式推荐方法[D].吉林大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[17]张洪涛,詹云峰,GeorgBastian,UliLemmer.纳米线多型异质结碳化硅室温单电子晶体管研究[J].固体电子学研究与进展,2013,05:405-409.
[18]刘智.流形上的共形变换[D].山西师范大学,基础数学,2014,硕士.
[19]于昕.基于非快时尚服饰品牌的买手模式研究[D].吉林大学,服装设计与工程,2014,硕士.
[20]庞刚.眶尖区薄层断层解剖和显微外科解剖学研究[D].安徽医科大学,人体解剖与组织胚胎学,2004,硕士.
[21]郑文.数据挖掘在股票分析中的应用[D].复旦大学,软件工程,2012,硕士.
[22]董辰昊.高架快速路驶出匝道与常规道路衔接模式及仿真研究[D].长安大学,交通工程,2013,硕士.
[23]魏宝林.锡矿山粗颗粒水砂充填采矿方法试验研究—I.W.F.采矿方法[J].有色金属(矿山部分).1992(02)
[24]许炳娜.中国石化长沙分公司成品油市场竞争战略研究[D].湖南大学,MBA,2013,硕士.
[25]胡青山.厦门太古飞机维修库大跨度网架的逐条积累滑移施工[D].重庆大学,建筑与土木工程,2003,硕士.
[26]刘伯鑫.新型混合型超导限流器与电网距离保护配合问题的研究[D].湖南大学,电气工程,2012,硕士.
[27]杨开,金月忠,邢辰,胡江宁,王如伟,孙培龙.松木层孔菌多糖PP60-S1分离、结构表征及抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2014,20:76-81.
[28]赵杰.底部两层框架—抗震墙砌体房屋墙柱梁楼梯整体体系抗震防线研究[D].山东建筑大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[29]陈凯.“中国梦”视域下大学生社会主义核心价值观培育路径研究[D].重庆工商大学,思想政治教育,2014,硕士.
[30]张翠红.基于Kinect深度相机的室内三维场景重构[D].大连理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[31]颜宁.荷脑胶质瘤裸鼠放疗前后~(99m)Tc-HL91乏氧显像及HIF-1α表达的相关性研究[D].辽宁医学院,肿瘤学,2012,硕士.
[32]刘振华.被边缘化的腹地：近代南阳盆地社会变迁研究（1906-1937）[D].南京大学,中国近现代史（专业学位）,2011,博士.
[33]杨超.主动式冷梁（ACB）控制系统的研制[D].山东大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[34]李春艳.新时期高校基层党组织生活建设研究[D].长春工业大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[35]王秀峰,李波.随机非线性系统辨识的正交优选算法[J].自动化学报,1993,03:264-270.
[36]唐志勇,何芳,部丽娟,谷铁安,杨大威,傅迎春,谢青季,姚守拙.配位聚合物及其在分析传感方面的应用[J].化学传感器,2013,01:3-11.
[37]夏建伟,徐胜元,邹云,晏谢飞.连续随机时滞系统L_2-L_∞滤波设计[J].控制与决策,2008,05:597-600.
[38]陈天昊.WTO《政府采购协议》对我国政府采购救济制度之借鉴与完善[D].西南政法大学,宪法学与行政法学,2012,硕士.
[39]张海玲,过仲阳,吴健平,林珲.决策树方法在环境物理量场与暴雨之间关系研究中的应用[J].地球信息科学,2005,04:39-42.
[40]韩丽瑄.国产卡维地洛和倍他乐克治疗心力衰竭对心肺功能的影响[D].山西医科大学,心血管内科,2002,硕士.
[41]陶菊良.五年一贯制高职数学中“学案导学”教学模式的探索研究[D].苏州大学,教育（专业学位）,2012,硕士.
[42]江涛.声乐艺术审美要素及其培养与结合[D].华东师范大学,音乐学,2013,硕士.
[43]王庆堂.氧化铝纳米结构固相微萃取的研制及在生物挥发性有机物采样中应用[D].福州大学,2011.
[44]麻和平.集成化报刊信息服务平台—报刊信息的组织、处理和检索[J].中国新闻科技.1998(12)
[45]刘俊.盾构隧道施工对邻近桩基的形变影响研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[46]李淑华.基于电流与振动信息融合技术的电机轴承故障诊断[D].河北科技大学,计算机技术,2013,硕士.
[47]刘红梅.论法治在构建和谐社会中的作用[D].延安大学,马克思主义基本原理,2014,硕士.
[48]于永强.长沙地区保障性住房单体设计研究[D].湖南大学,建筑学,2012,硕士.
[49]杜伟.重载铁路曲线段轮轨磨耗影响因素分析[D].西南交通大学,车辆工程,2012,硕士.
[50]邓新贤.抗条锈病新小种小麦品系的抗性鉴定、遗传分析及SSR分子标记[D].西南大学,植物学,2013,硕士.