六味补气胶囊对慢性阻塞性肺病肺气虚证大鼠的防治及作用机理

【摘要】1目的本研究观察大鼠呼吸系统症状体征及肺功能，检测COPD肺气虚证大鼠辅助T细胞（Th）、调节性T细胞（Treg）、树突状细胞（DC）、热休克蛋白（HSP70）、基质金属蛋白酶系统（MMPs/TIMPs）、细胞信号转导转录激活因子（STAT）、JAKs/STATs信号通路、T-bet、RORγt、GATA变化，同时观察六味补气胶囊对上述指标的干预，探讨六味补气胶囊防治COPD肺气虚证大鼠的作用机制。2方法2.1动物分组将大鼠随机分为正常组、模型组、模型空白组（以下简称模空组）、模型安慰剂组（以下简称模安组）、六味补气胶囊预防组（以下简称六预组）、六味补气胶囊治疗组（以下简称六味补气组）、金水宝组、脾氨肽组，每组10只。2.2模型复制除正常组大鼠外，其余大鼠于实验第1天、14天采用10%水合氯醛麻醉，手术暴露气管，注入1mg.mL-1脂多糖200μL至气管内。脂多糖滴入的次日，将大鼠置于动物气雾吸入仪中，用50g锯末加7.11g香烟烟丝混和点燃烟熏，每日烟熏1次，每次30min。造模周期28d。COPD模型成功标准依据肺组织影像学、肺功能及肺组织病理形态学变化。于第22天改烟熏次数为3次/天。二次复制肺气虚证模型成功依据肺功能及大鼠生物学症状、体征变化，大鼠生物学症状、体征变化包括反映肺气虚有无的一般情况、活动量、毛发、体质量、饮食量、咳嗽、呼吸频率等，其中呼吸频率为大鼠平静呼吸时每分钟呼吸次数。2.3药物干预于模型复制第1天开始，模空组、模安组、六预组大鼠预防给药剂量如下：模空组大鼠未予任何药物或安慰剂；模安组大鼠予生理盐水，按照10mL·kg-1·d-1剂量灌服，一天一次，连续灌服28d；六预组大鼠予六味补气胶囊混悬液，按照0.4g·kg-1·d-1（相当于临床成人常规用量的10倍）剂量灌服，一天一次，连续灌服28d。模型复制周期28d后治疗组给药，给药剂量按照体表面积计算得出。正常组、模型组灌服生理盐水10mL·kg-1·d-1，六味补气组灌服六味补气胶囊混悬液0.4g·kg-1·d-1，金水宝组灌服金水宝胶囊混悬液0.495g·kg-1·d-1，脾氨肽组灌服脾氨肽水溶液0.33mg·kg-1·d-1，各药物组剂量均相当于成人常规临床用量的10倍，1次/天，共给药30d。2.4指标检测分别于预防给药28d及治疗给药30d后观察和检测以下指标：呼吸系统症状体征、肺功能、肺组织病理形态学变化，血清细胞因子、Th1、Th2、Th17细胞变化，外周血Treg表达、肺组织DC、HSP70表达，肺组织MMPs/TIMPs、JAKs/STATs信号通路、T-bet、RORγt、GATA变化。3结果3.1COPD肺气虚证大鼠指标表达及相关性分析3.1.1COPD肺气虚证大鼠呼吸系统改变COPD肺气虚证大鼠出现蜷伏少动，拱背蜷卧，撮毛，食量减少，毛失光泽、发黄、易脱落，体质量较正常组减轻；模型组呼吸急促，呼吸频率明显高于正常组，呼吸道有分泌物从口鼻流出，偶可闻及咳嗽及气道痰鸣音，随着造模时间的延长。与正常组比较，模型组大鼠肺功能参数FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC降低；肺系数、肺泡炎积分及病理学总积分升高。3.1.2COPD肺气虚证大鼠细胞因子变化及相关性分析COPD肺气虚证大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-12升高，IL-10、IL-13、IL-35表达降低。肺功能参数FEV0.3与IL-10呈正相关，FEV0.3/FVC与IL-13呈正相关，PEF与IL-35呈正相关，肺泡炎积分与IL-6呈正相关，肺病理学积分与IL-1β、IL-12呈正相关。肺功能参数FVC与IL-6呈负相关，FEV0.3/FVC与IL-1β呈负相关，呼吸频率与IL-13呈负相关。3.1.3COPD肺气虚证大鼠Th细胞变化及相关性分析COPD肺气虚证大鼠血清IFN-γ、IL-17、Th1/Th2升高，血清IL-4和肺组织IL-4蛋白降低，肺组织IFN-γ、IL-17蛋白表达升高。肺功能参数FEV0.3/FVC与血清IL-4呈正相关，肺泡炎积分与Th1/Th2呈正相关。肺功能参数FEV0.3与血清IFN-γ、肺组织IFN-γmRNA呈负相关，FVC与IFN-γ蛋白呈负相关，FEV0.3/FVC与Th1/Th2呈负相关，PEF与IL-17蛋白呈负相关；肺泡炎积分与IL-4蛋白呈负相关，肺病理学积分与IL-17、IFN-γ蛋白呈正相关。3.1.4COPD肺气虚证大鼠Treg变化及相关性分析COPD肺气虚证大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+FoxP3+Treg降低，肺组织FoxP3蛋白表达降低。肺功能参数FEV0.3与FoxP3蛋白呈正相关，FVC与CD4+CD25+Treg呈正相关，FEV0.3/FVC与CD4+CD25+FoxP3+Treg呈正相关。肺泡炎积分与CD4+CD25+FoxP3+Treg呈负相关，肺病理学积分与FoxP3蛋白呈负相关。3.1.5COPD肺气虚证大鼠DC、HSP70变化及相关性分析COPD肺气虚证大鼠肺组织DC、HSP70阳性表达面积增加、平均光密度增强。肺泡炎积分、肺病理学积分分别与DC、HSP70光密度值呈正相关。肺功能参数FEV0.3与DC光密度呈负相关，PEF、FEV0.3/FVC与HSP70光密度呈负相关。3.1.6COPD肺气虚证大鼠MMPs/TIMPs变化及相关性分析COPD肺气虚证大鼠肺组织MMP-9、MMP-12呈强阳性表达，表达强度明显增强。且肺组织MMP-9基因和蛋白表达升高，TIMP1基因和蛋白表达降低。肺功能参数FEV0.3/FVC与TIMP1蛋白呈正相关，肺泡炎积分与MMP-9光密度呈正相关，肺病理学积分与MMP-12光密度呈正相关。FEV0.3与MMP-9蛋白呈负相关，FVC与MMP-9光密度呈负相关，FEV0.3/FVC与MMP-12光密度呈负相关；呼吸频率与TIMP1mRNA呈负相关。说明基质金属蛋白酶系统的表达紊乱，导致细胞外基质生成增加，进而影响COPD肺气虚证大鼠肺组织重塑，影响肺的通气功能，导致肺功能降低和肺组织损伤。3.1.7COPD肺气虚证大鼠JAKs/STATs变化及相关性分析COPD肺气虚证大鼠肺组织JAK1、STAT3mRNA表达，STAT4阳性面积率、平均光密度升高，JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表达升高；STAT6阳性面积率、平均光密度较模型组降低。肺功能参数FEV0.3/FVC与STAT6呈正相关，呼吸频率与p-STAT3蛋白呈正相关，肺泡炎积分、肺病理学积分与STAT4呈正相关。FEV0.3与p-JAK1呈负相关，FVC与STAT3mRNA呈负相关，FEV0.3/FVC与STAT3呈负相关，肺泡炎积分与STAT6、p-JAK1呈负相关。3.1.8COPD肺气虚证大鼠T-bet、RORγt、GATA变化及相关性分析COPD肺气虚证大鼠肺组织GATA-3mRNA、蛋白表达降低，T-bet、RORγtmRNA和蛋白表达升高。肺组织T-bet、RORγt蛋白和T-bet/GATA-3比值较正常组升高，GATA-3蛋白降低。肺功能参数FEV0.3与肺组织GATA-3mRNA呈正相关，呼吸频率与RORγt蛋白呈正相关，肺泡炎积分与T-bet蛋白呈正相关，肺病理学积分与T-betmRNA呈正相关(P<0.05，P<0.01)。FEV0.3与RORγt蛋白呈负相关，FEV0.3/FVC与T-betmRNA呈负相关，PEF与RORγtmRNA呈负相关，肺病理学积分与GATA-3蛋白呈负相关(P<0.05)。3.2六味补气胶囊对COPD大鼠的防治作用3.2.1六味补气胶囊对COPD肺气虚证大鼠呼吸系统的防治与模型组比较，六味补气预防和治疗组大鼠蜷伏少动，拱背蜷卧，撮毛，食量减少，毛失光泽、发黄、易脱落症状、体征改善，体质量升高，呼吸频率降低。六味补气预防和治疗组大鼠肺功能参数FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC升高。六味补气预防和治疗组大鼠气管、支气管有炎性细胞浸润，但数量较模型组减少；上皮坏死、脱落；肺泡间隔破坏较少，部分肺泡扩张成大小不等的囊泡；纤毛排列较规整。六味补气预防和治疗组肺系数、肺泡炎积分及病理学总积分降低。与六味补气组比较，脾氨肽组FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF降低；病理学总积分比较，六味补气组较脾氨肽组降低。3.2.2六味补气胶囊对COPD肺气虚证大鼠细胞因子的防治与模型组比较，六味补气预防和治疗组IL-1β、IL-6、IL-12降低；IL-10、IL-13、IL-35表达升高。与六味补气组比较，脾氨肽组IL-1β、IL-6表达升高，IL-10、IL-35表达降低；金水宝组IL-12表达升高。3.2.3六味补气胶囊对COPD肺气虚证大鼠Th细胞的防治与模型组比较，六味补气预防和治疗组血清IFN-γ、IL-17、Th1/Th2表达降低，IL-4升高；肺组织IL-4mRNA、IL-4蛋白升高、IFN-γmRNA、IL-17蛋白降低。与六味补气组比较，金水宝组血清IL-4降低、血清IL-17、Th1/Th2升高，脾氨肽组IFN-γ、IL-17升高。与六味补气组比较，金水宝组肺组织IL-17升高；脾氨肽组肺组织IL-4蛋白降低，IFN-γ升高。3.2.4六味补气胶囊对COPD肺气虚证大鼠Treg的防治与模型组比较，六味补气预防和治疗组外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+FoxP3+Treg升高，肺组织FoxP3蛋白表达升高。与六味补气组比较，脾氨肽组、金水宝组CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+FoxP3+Treg表达降低；脾氨肽组FoxP3蛋白升高。3.2.5六味补气胶囊对COPD肺气虚证大鼠DC、HSP70的防治与模型组比较，六味补气预防和治疗组肺组织DC、HSP70光密度下降、阳性面积率减小。各治疗组之间统计分析显示，未见统计学差异(P>0.05)。3.2.6六味补气胶囊对COPD肺气虚证大鼠MMPs/TIMPs的防治与模型组比较，六味补气预防和治疗组肺组织MMP-9、MMP-12表达强度明显降低；TIMP1阳性表达增强。肺组织MMP-9基因和蛋白表达降低，TIMP1基因和蛋白表达升高。与六味补气组比较，脾氨肽组MMP-9光密度值升高，TIMP1降低；金水宝组、脾氨肽组MMP-9蛋白升高，TIMP1蛋白表达降低。3.2.7六味补气胶囊对COPD肺气虚证大鼠JAKs/STATs的防治与模型组比较，六味补气预防和治疗组肺组织STAT4阳性面积率、平均光密度降低，STAT6阳性面积率、平均光密度较模型组增大。JAK1mRNA表达及JAK1、p-JAK1、p-STAT3、STAT4蛋白蛋白表达下降；STAT6蛋白升高。与六味补气组比较，金水宝组JAK1、p-JAK1蛋白升高；脾氨肽组JAK1mRNA及JAK1、p-STAT3蛋白升高；脾氨肽组STAT6蛋白升高降低。3.2.8六味补气胶囊对COPD肺气虚证大鼠T-bet、RORγt、GATA的防治与模型组比较，六味补气预防和治疗组GATA-3mRNA、蛋白表达升高，T-bet、RORγtmRNA和蛋白表达降低。与六味补气组比较，金水宝组T-betmRNA和蛋白、T-bet/GATA-3、RORγt基因升高，GATA3蛋白降低；脾氨肽组T-bet蛋白、RORγt基因表达升高。4结论六味补气胶囊防治COPD肺气虚证大鼠的作用机制如下：4.1改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统症状体征中药六味补气胶囊通过改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统症状体征，升高肺功能参数。降低肺系数、肺泡炎积分、病理学总积分。降低肺组织炎性细胞浸润，改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统的症状体征，进一步提高肺功能水平和改善肺组织损伤。4.2降低COPD肺气虚证大鼠炎症反应中药六味补气胶囊能够上调COPD肺气虚证大鼠血清IL-10、IL-13、IL-35表达，下调IL-1β、IL-6、IL-12表达水平，降低机体炎性反应，纠正血清细胞因子表达失衡状态，减少炎症介质渗出及对肺组织器官的刺激，改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统症状体征。4.3调节COPD肺气虚证大鼠Th细胞平衡中药六味补气胶囊通过上调IL-4表达，下调IFN-γ、IL-17，降低Th17细胞分泌，纠正Th1/Th2细胞平衡，降低炎性细胞分泌，调整肺组织细胞及体液免疫，减轻胞膜通透性，从而改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统症状体征。4.4上调COPD肺气虚证大鼠Treg表达中药六味补气胶囊通过上调CD4+Treg、CD4+CD25+Treg、FoxP3mRNA及FoxP3蛋白表达，抑制CD4+CD25+Treg向CD4+CD25-T细胞进一步分化，减少炎症介质的释放，减少炎症反应对组织的损伤，从而改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统症状体征。4.5降低COPD肺气虚证大鼠DC、HSP70表达中药六味补气胶囊通过下调DC、HSP70表达，降低炎性细胞对肺组织刺激，从而改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统症状体征。4.6调节COPD肺气虚证大鼠MMPs/TIMPs系统中药六味补气胶囊通过上调TIMP1表达，下调MMP-9、MMP-12，纠正MMP-9/TIMP1平衡状态，抑制机体炎症反应，从而改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统症状体征。4.7调节COPD肺气虚证大鼠JAKs/STATs通路表达中药六味补气胶囊可能是通过上调STAT6表达，下调JAK1、p-JAK1、p-STAT3表达，调控JAK/STAT信号转导，抑制AKs/STATs信号通路过激活状态，改善气道炎症和气流受限症状，从而改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统症状体征。4.8调节COPD肺气虚证大鼠T-bet、RORγt、GATA表达中药六味补气胶囊可能是通过下调T-bet、RORγt表达，上调GATA-3表达，从而改善COPD肺气虚证大鼠呼吸系统症状体征。
【作者】王成阳；
【导师】李泽庚；
【作者基本信息】湖北中医药大学，中医内科学，2014，博士
【关键词】慢性阻塞性肺病；肺气虚证；免疫；六味补气胶囊；中药防治；

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