鄂西北白及产地适宜性与品质评价研究

【摘要】目的考察白及野生资源分布区域及产地生态适宜性,探讨白及组织培养的条件和方法、对白及质量评价方法进行研究,为鄂西北地区白及的规模化种植、资源开发与利用提供参考依据。方法1.白及的品种整理与鉴别研究1.1白及产地适宜性分析在对中国植物数字标本馆(CVH)收载的近600份白及与近缘物种小白及、黄花白及、华白及的标本数据进行整理、分析的基础上,利用中药材产地适宜性分析地理信息系统(TCMGIS)技术,对适宜白及生长的环境及其影响因子进行分析,得出相似度在95～100%的适宜白及规模化种植生长环境因素。1.2白及的DNA条形码鉴别研究提取白及药材及射干、黄精、玉竹、知母等混伪品共8个物种39余份样品DNA,PCR扩增其ITS2序列并双向测序,应用CodonCodeAlignerv4.25对测序峰图进行校对拼接,并去除低质量序列及引物区,得到ITS2序列。用MEGA6.0软件计算物种种内和种间Kimura2-parameter(K2P)遗传距离,分析变异位点并构建NJ系统发育树,综合应用相似性搜索法、最近距离法以及NJ系统发育树等进行鉴定分析。1.3鄂西北白及品种鉴别研究建立白及与黄花白及的药材性状、显微、理化、TLC等特征鉴别方法。对白及与黄花白及根茎横切面进行显微鉴定、理化鉴定、薄层色谱鉴别研究。2.白及组织培养技术研究考察不同激素浓度和配比对白及不同外植体诱导分化、增殖及生根的影响。通过对白及外植体诱导苗的分化、丛生芽的增殖以及生根培养,建立了白及组培快繁体系；研究白及组培扩繁的方法,探讨白及组培最佳部位与最佳培养基配比。3.鄂西北白及的品质评价研究3.1白及的质量评价研究探讨蒽酮-硫酸法测定多糖含量的影响因素,优选白及多糖含量测定的最优条件。对鄂西北地区不同产地的白及中所含的白及多糖含量进行测定,采用水提醇沉法提取白及多糖,以蒽酮-硫酸试剂为显色剂,采用紫外分光光度法测定多糖含量。测定鄂西北地区白及块茎中总酚的含量,以没食子酸为对照品,采用Folin-酚比色法,运用可见-紫外分光光度法测定不同产地白及块茎中总酚的含量,并进行了水分、灰分、重金属的测定。采用HPLC法,建立测定不同产地白及药材中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量的HPLC方法,对其含量采用均数法进行聚类分析。通过对鄂西北地区19批次的白及进行梯度洗脱,建立鄂西北地区白及化学成分的HPLC指纹特征图谱。3.2白及主要成分研究采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)萃取白及中挥发性成分,并用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对白及的挥发性成分进行分析。采用ABSciex4000Q-TRAP型质谱仪多重反应监测(MRM)扫描模式对白及对照药材和白及样品分别进行检测。测定白及中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯、原儿茶酸和咖啡酸的含量,建立了基于Q-TRAPLC-MS的白及活性成分的检测方法。4.白及药理作用研究分别对白及乙酸乙酯、正丁醇及水部位进行出、凝血时间测定,初步筛选出白及止血、活血部位；再通过大鼠血瘀模型和小鼠胃溃疡模型,进一步论证EtOAc部位对血瘀模型大鼠血液流变学各项指标的影响以及n-BuOH部位对小鼠胃溃疡模型的影响,探讨白及不同提取部位对血液流变学的影响与药理活性。结果1.白及品种整理与鉴别研究1.1白及产地适宜性分析通过对中国数字植物标本馆白及项下的近600份白及及其近缘种小白及、黄花白及、华白及的标本进行数据的录入,内容包括标本馆名称、条形码、采集人、采集时间、采集地、坐标、鉴定人、鉴定时间、鉴定结果等内容,通过对白及的采集地点进行整理、汇总、分析,基于“中药材产地适宜性分析地理信息系统”(TCMGIS)中基础地理信息数据库、气候因子数据库、土壤数据库和中药材分布空间数据库四个数据库中的图表索引和空间分析功能,提取白及标本点处的上述数据库中的气候数据和土壤数据,然后对数据进行系统分析,得出适宜白及规模化种植生长环境因素,对白及的规模化种植提供科学依据。1.2白及的DNA条形码鉴别研究白及的最大种内K2P遗传距离为0.035,远小于其与混伪品的种间最小遗传距离为0.31；NJ树结果显示,14条白及序列单独聚为一枝,且与混伪品可明显区分。以上鉴定方法分析结果表明,ITS2序列能将白及药材与混伪品鉴别开1.3鄂西北白及品种鉴别研究通过对白及根茎横切面进行显微鉴定、理化鉴定、薄层色谱鉴别,鄂西北地区的白及经鉴定主要为兰科白及属植物白及Bletillastriata、黄花白及Bletillaochracea两个来源,白及与黄花白及薄层色谱鉴别,无明显区别。2.白及幼根组织培养技术研究通过研究不同浓度激素和不同激素配比对白及不同外植体诱导分化、增殖及生根的影响。结果表明,幼根最容易诱导出丛生芽,其最佳培养基为1/2MS+1.0mg/L6-BA+2.0mg/LNAA;丛生芽增殖最佳培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA;生根培养基以1/2MS+0.5mg/LNAA为最佳。白及叶片丛生芽在本实验中没有诱导出来,鳞茎丛生芽诱导率也比较低且后期生长缓慢。3.鄂西北白及的品质评价研究3.1白及多糖的含量测定研究在单因素试验的基础上,采用L9(34)正交试验,以加热时间、加热温度、蒽酮-硫酸试液的用量作为考察因素,以吸光度值为评价指标,优选蒽酮-硫酸法测定白及多糖含量的最佳条件。最佳测定条件是蒽酮-硫酸试液用量为4.5mL,加热温度为100℃,加热时间为3min,显色剂浓度0.2%,测定波长625nm。精制白及多糖换算因子f为1.69。对鄂西北地区不同产地的白及多糖含量进行测定,采用水提醇沉法提取白及多糖,以蒽酮-硫酸试剂为显色剂,采用紫外分光光度法测定多糖含量。测定结果显示,鄂西北地区不同产地的白及药材中多糖的含量相差较大。3.2白及总酚的含量测定研究以没食子酸为对照品,采用Folin-酚比色法,运用可见-紫外分光光度法测定不同产地白及块茎中总酚的含量。不同产地的白及药材中总酚含量差异较大,说明生长环境对白及总酚含量有明显影响。3.3白及中苹果酸酯的含量测定研究采用HPLC法,测定不同产地的白及药材,1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量差别明显,对其含量采用均数法进行聚类分析,结果显示,1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯含量高低有明显的地域性。3.4白及水分、灰分、重金属测定对不同产地的白及进行水分、灰分检测,结果表明,不同产地的白及样品中总灰分、水分均未超标,不同产地白及之间的总灰分含量有一定的差异。针对不同产地白及中的铅、镉、铜等重金属,通过原子吸收光谱法(AAS)进行测定,结果表明,鄂西北不同产地的白及样品中重金属铅、镉、铜的含量,仅有个别品种铜的含量超标,其余均在合格范围内。3.5白及指纹图谱研究建立鄂西北地区白及化学成分的HPLC指纹特征图谱。用乙腈和水为流动相,进行梯度洗脱,不同产地的15批白及药材化学成分特征图谱共检出9个分离度良好的共有峰。通过聚类分析,白及药材产地与特征图谱相似度差异不大。3.6白及主要化学成分研究采用顶空固相微萃取法(HS-SPME)萃取白及中挥发性成分,并用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对白及的挥发性成分进行分析,从白及中共分离出27个色谱峰,经化学工作站数据处理系统及用面积归一化法从其总离子流图中计算了各组分的百分含量,按各峰的质谱图经计算机质谱数据库检索,鉴定出其中11种化合物,占总量的91.25%。其中主要成分为对甲酚(47.22%)、已醛(43.33%)等。测定白及中活性成分1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯、原儿茶酸和咖啡酸的含量,建立了基于Q-TRAPLC-MS/MS的检测方法。采用ABSciex4000Q-TRAP型质谱仪多重反应监测(MRM)扫描模式对白及对照药材和白及样品分别进行检测。白及中1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯、原儿茶酸和咖啡酸的含量分别为0.7088mg/g、0.0011mg/g和0.0004mg/g。4.白及药理作用研究通过对白及乙酸乙酯、正丁醇及水部位不同提取部位进行出、凝血时间测定,结果表明,EtOAc部位具有活血作用,n-BuOH及水部位具有止血作用；EtOAc部位高、中、低剂量均可显著地降低血瘀模型大鼠的血液流变学各项指标,n-BuOH部位有显著改善胃溃疡的作用。结论1.通过对白及样本的分析,提取了适宜白及生长的温度、气候、土壤条件,鄂西北地区在白及产地适宜性相似度100%的区域内,适宜白及的规模化种植。2.ITS2序列能准确鉴别白及药材与混伪品,为避免白及药材混用及保障临床安全用药提供了新的技术手段。3.通过研究不同激素浓度和配比对白及不同外植体诱导分化、增殖及生根的影响,建立了白及幼根组织培养体系。4.对鄂西北地区不同产地的白及中多糖、多酚、1,4-二[4-(葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯的含量进行测定,建立了白及药材多指标成分质量控制体系,为保证白及的质量提供了依据。5.建立了白及的指纹图谱质量评价体系,可以全面评价白及的质量。6.采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对白及的挥发性成分进行分析,并采用液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术对白及中主要化学成分进行了分析,全面而客观的分析了白及的化学成分。7.通过对白及不同提取部位的药理活性研究,白及乙酸乙酯部位具有活血作用,白及正丁醇部位可以显著改善出血症状。
【作者】陈黎；
【导师】陈士林；
【作者基本信息】湖北中医药大学，中医基础理论，2014，博士
【关键词】白及；产地适宜性；DNA条形码；白及多糖；品质评价；

【参考文献】
[1]于晓颖.汽车起重机电磁兼容性分析与实验研究[D].吉林大学,机械工程,2014,硕士.
[2]黄蓉.多极化MIMO系统性能研究[D].南京邮电大学,电磁场与微波技术,2013,硕士.
[3]任威.液压电机泵中浸油电机转子转速特性的研究[D].兰州理工大学,机械电子工程,2013,硕士.
[4]颜鹏程.一种气候突变“过程性”识别新方法及其应用[D].西北师范大学,理论物理,2013,硕士.
[5]任荣.内容挖掘──考研英语写作的突破点[J].淮北煤师院学报(哲学社会科学版),2001,Z1:149-150+153.
[6]陈剑文.论入世后我国广告法制之完善[D].湘潭大学,法律,2003,硕士.
[7]秦颖博.尿液中潜血细胞识别技术研究[D].天津理工大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[8]肖灿俊,董锦明.石墨烯线缺陷的电子valley滤波特性的数值模拟研究[J].南京大学学报(自然科学),2014,01:14-22.
[9]贾朝勃.公共日语教材语法体系探讨[J].郑州大学学报(哲学社会科学版),2015,02:132-134.
[10]吴今明,唐意祥,张亚杰.改善混凝沉淀效能的探讨(下)[J].城市公用事业.1995(02)
[11]吴瑞.基于J2EE架构的城市规划电子政务系统的设计与开发[D].清华大学,2004.
[12]陈江.除草剂敌草快及其中间体的合成研究[D].浙江工业大学,农药学,2004,硕士.
[13]于洪远.大庆地区奶牛场DHI体系应用的调查研究[D].黑龙江八一农垦大学,兽医,2014,硕士.
[14]张延忠.几种非晶态铁磁合金的磁导率稳定性的估计[J].金属学报.1989(06)
[15]袁汀.RSA患者外周血Th17和Treg细胞特异性转录因子与相关细胞因子的初步研究[D].郑州大学,临床检验诊断学,2013,硕士.
[16]荣吉赞.基于定向碳纳米管阵列场效应晶体管的一氧化氮检测[D].辽宁大学,2011.
[17]刘家琦.滨海旅游区域的城市设计研究[D].青岛理工大学,建筑设计及其理论,2012,硕士.
[18]华凌.美用石墨烯油墨打印出高导电柔性电极[N].科技日报,2013-05-06002.
[19]吴治江.基于摩擦诱导方法的多点接触微米级加工设备研制[D].西南交通大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[20]王芸.经济增加值（EVA）在财产保险公司的应用研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[21]张利君.环氧树脂/蓖麻油/丙烯酸酯多重改性聚氨酯[D].合肥工业大学,化学工程,2013,硕士.
[22]李承泽.压电纤维复合材料自适应后缘结构设计与分析[D].哈尔滨工业大学,工程力学,2014,硕士.
[23]尚磊.中国对海外投资地环境的规制[D].上海大学,法律,2013,硕士.
[24]王文瑞,顾继雄,吕洪涛.宝钢不锈钢铁区管理系统及应用(上)[J].冶金自动化,2011,03:1-7.
[25]许良,高自友.基于路段能力可靠性的城市交通网络设计[J].中国公路学报,2006,02:86-90.
[26]何高翔.武汉市冬泳运动开展现状调查与对策研究[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[27]代抒娉.独立与纠缠：1949-1977年中国课程与教学论发展的研究[D].山西师范大学,教育史,2014,硕士.
[28]洪明.PCI围手术期死亡病例的临床分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[29]鲍雨梅,高海明,许景顺,马龙,徐哲玉.激光熔覆生物陶瓷涂层物相分析[J].中国激光,2014,10:74-79.
[30]高春丽.农村初中英语作业的优化设计[D].首都师范大学,学科教学,2014,硕士.
[31]刘彦君.农村留守老人居家养老服务需求分析[D].河北经贸大学,社会保障,2013,硕士.
[32]邵诚俊,李修亮,苏宏业.基于多系统协调的密封舱压力智能化控制[J].机械工程学报,2014,21:105-110.
[33]吴骁航.基于RTX技术的雷达测试控制系统研制[D].哈尔滨工业大学,仪器仪表工程,2014,硕士.
[34]毕文杰.美国商业银行的破产对中国商业银行信用风险控制的启示[D].山西财经大学,金融学,2013,硕士.
[35]彭礼辉.机械臂运动学与路径规划研究[D].湖南工业大学,机械制造及自动化,2012,硕士.
[36]黄龙.热连轧厚度测量系统[D].济南大学,控制工程,2012,硕士.
[37]史卫林.有机电化学合成聚乙腈和甲基亚磺酸盐的研究[D].兰州大学,化学工程,2012,硕士.
[38]林树地.基于Hadoop的决策树分类算法研究[D].华侨大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[39]肖思达.彩色视频超分辨率重建算法及其硬件实现研究[D].华南理工大学,微电子学与固体电子学,2014,硕士.
[40]历美彤.多孔晶态碳基材料的制备及电容特性的研究[D].黑龙江大学,2014.
[41]闫一鸣.冠心病患者血脂水平与性别的关系[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[42]任雪娇.基于央行逆回购的商业银行资产负债调整研究[D].山西财经大学,金融学,2014,硕士.
[43]易婷.广义超弹性杆波动方程解的存在性和稳定性[D].西北大学,基础数学,2014,硕士.
[44]薛鲁静.论有限责任公司股东的退股权[D].黑龙江大学,民商法学,2013,硕士.
[45]杨红梅.VSAT系统在农村通信中的应用[J].电信网技术.2006(05)
[46]王苗.双向/多向中继系统传输方案设计[D].北京交通大学,2014.
[47]宫相宽.陕西凤县九子沟超镁铁岩—正长岩体形成时代及其地质意义[D].西北大学,矿物学、岩石学、矿床学,2013,硕士.
[48]殷玲.雄激素及其受体在原发性痛风性关节炎患者的变化及其临床意义[D].川北医学院,内科学,2013,硕士.
[49]凌娜.小麦TaMBD2基因的全长cDNA克隆及互作蛋白的筛选[D].河南农业大学,生物化学与分子生物学,2011,硕士.
[50]骆自超.基于数据挖掘的发动机缸盖燃烧室容积制造误差控制方法研究[D].上海交通大学,车辆工程,2014,硕士.