模式识别受体在中华绒螯蟹特异性先天免疫中的功能研究

【摘要】中华绒螯蟹是我国重要的养殖经济动物品种,是长江流域居民的重要传统食物。随着对其集约化养殖的大规模发展,由细菌,病毒或立克次氏体引起的各种疾病随之大规模爆发,造成了巨大的经济损失。因此针对该物种先天免疫系统以及生物防御机制的深入研究刻不容缓。先天免疫和适应性免疫(获得性免疫)是动物宿主(Host)防御病毒、细菌和寄生虫等病原体(Pathogen)的两种免疫防御形式,两者间本质的区别在于：适应性免疫包括抗原特异性识别和免疫记忆,而先天免疫则没有。目前认为,先天免疫存在于所有后生动物中,而适应性免疫则仅存在于高等脊椎动物。无脊椎动物先天免疫“非己”识别的基础是其体内存在某些模式识别受体(PRRs),能够特异性地识别并结合病原体表面保守的病原相关分子模式(PAMPs),如脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和葡聚糖(GLU)等。通过识别PAMPs,这些受体可以激活免疫系统中的蛋白酶以及通过免疫细胞内的信号转导途径引发免疫反应。本研究通过RNA-Seq高通量二代测序技术,构建了中华绒螯蟹血细胞经病原相关模式分子差异诱导后的转录组文库,从中筛选得到了无脊椎动物重要的模式识别受体分子。其中C型凝集素蛋白(C-typelectindomain,CTLDcontainingproteins)家族基因具有庞大的基因组分子多样性(至少存在40种以上的亚型分子),从而能够在蛋白质水平产生丰富的功能多样性。同时,本研究还发现单个免疫基因能够通过转录水平的外显子可变剪切调控,从而使得单个免疫分子产生数以万级的分子多样性,例如免疫球蛋白超家族基因Dscam,并针对其在中华绒螯蟹先天免疫系统中的重要功能进行了深入研究。针对无脊椎动物模式识别受体C型凝集素在甲壳动物中的分子多样性和特异性免疫功能,我们基于E.sinensis进行了以下研究。通过本实验室成功构建的一系列基于RNA-Seq的表达序列标签cDNA文库以及血细胞转录组文库,我们克隆得到四条C型凝集素基因,分别是EsLecA、EsLecF和EsLecG。通过序列比对和聚类分析发现上述基因序列均具有一个N端信号肽和一个C端糖类识别功能域(CarbohydrateRecognitionDomain)。转录水平检测结果表明(1)EsLecA和EsLecG在所有检测组织中均表达；(2)经脂多糖(LPS)诱导后,EsLecA和EsLecG在肝胰腺、鳃和血细胞等免疫器官中均有不同程度的诱导表达；而EsLecF仅在肝胰腺中特异性表达,并且经LPS诱导后能够大量表达。原核表达重组rEsLecA、rEsLecF和rEsLecG蛋白能够广泛结合不同的病原微生物,包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌,并且其微生物结合活性是钙离子不依赖的。病原微生物生长抑制检测和抗菌活性检测结果表明rEsLecA、rEsLecF和rEsLecG蛋白均能够不同程度地抑制细菌生长甚至直接杀死细菌。体外细胞包裹实验验证了rEsLecA、rEsLecF和rEsLecG蛋白均具有不同程度的细胞调理活性,并能够在体外刺激血细胞的包裹活性。通过上述研究,初步阐明了中华绒螯蟹C型凝集素具有核酸水平的分子多样性和蛋白水平的功能多样性,为甲壳动物乃至其他无脊椎动物先天免疫特异性分子机制的研究提供了重要参考。近年来,无脊椎动物先天免疫的特异性水平及其免疫记忆受到了极大关注,“替代适应性免疫”(Alternativeadaptiveimmunity)在节肢动物、软体动物以及棘皮动物等无脊椎动物中的发现,使得“适应性免疫是脊椎动物免疫的一种专有特征”这一传统观点受到了严峻挑战。节肢动物Dscam基因可通过外显子选择性剪切方式产生惊人的分子多态性从而特异性地识别不同的病原体。我们从大量转录组信息的分析中发现并成功克隆得到了中华绒螯蟹Dscam基因(EsDscam),通过生物信息学比对分析发现其由典型功能域组成,包括1个信号肽(Signal-peptide),10个免疫球蛋白功能域(Immunoglobulin,Igdomains),6个三型纤连蛋白功能域(FibronectintypeⅢdomains,FNⅢ),一个跨膜功能域(Transmembranedomain,TM)和一个细胞质尾(Cytoplasmictail)。在EsDscam中我们通过TA克隆测序技术发现了4个可变剪切区：Ig2功能域的N端部分(25个亚型),Ig3功能域的N端部分(30个亚型),Ig7功能域(18个亚型)和跨膜功能域(2个亚型),至少可以产生27000种不同的亚型。EsDscam在E.sinensis的所有组织中均广泛表达,尤其是在免疫系统、消化系统和神经系统中表达最高。使用脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和葡聚糖(GLU)分别对E.sinensis进行体内免疫刺激后,EsDscam基因在血细胞中表现出了差异诱导表达模式。通过RACE-PCR技术,我们发现EsDscam具有两种表达类型,分别是跨模型(Transmembrane或Membrane-bound)和分泌型(Secreted或Cytosolic).且与跨模型相比,分泌型在不同模式分子(PAMPs)刺激后显著表达。免疫荧光定位结果证明EsDscam蛋白定位在中华绒螫蟹血细胞表面。本研究初步阐明中华绒螯蟹Dscam基因能够通过外显子可变剪切产生数以万级的分子多样性及其经病原刺激后的差异诱导剪切现象,为后续针对其免疫识别的功能多样性研究提供数据支持,为中华绒螯蟹乃至甲壳动物疫苗的研发提供了一定的理论基础。
【作者】金兴坤；
【导师】王群；
【作者基本信息】华东师范大学，动物学，2014，博士
【关键词】抗菌活性；中华绒螯蟹；血细胞；包裹作用；特异性免疫识别；模式识别受体；

【参考文献】
[1]王玉萍.Behind the Beautiful Forevers节选汉译报告[D].中国海洋大学,英语笔译（专业学位）,2014,硕士.
[2]邢森.透明质酸修饰的载药液态氟碳纳米胶囊[D].哈尔滨工业大学,生物医学工程,2014,硕士.
[3]范永庚.昆明呈贡大学城公共文化服务建设的政策供给研究[D].云南师范大学,行政管理,2013,硕士.
[4]林屹,严洪森,周博.基于多维泰勒网的非线性时间序列预测方法及其应用[J].控制与决策,2014,05:795-801.
[5]王丹.唐代诗僧拾得研究[D].浙江工业大学,中国古代文学,2012,硕士.
[6]姜瑞其.试析知识管理在美国图书馆参考咨询服务中的应用[J].图书情报知识,2005,04:102-104+108.
[7]高峻峻,王迎军,郭亚军,吕芹.供应链管理模型的分类和研究进展[J].中国管理科学,2005,05:118-127.
[8]张荣.IP电话的现状与未来[J].电信网技术.2000(03)
[9]张治菁,曹运红.树脂传递模塑工艺的发展及其在飞行器上的应用[J].飞航导弹.2002(11)
[10]钱生,陈宗海,林名强,张陈斌.基于条件随机场和图像分割的显著性检测[J].自动化学报.
[11]杨名军.基于ARM嵌入式移动图像监控系统的研究与设计[D].湖北工业大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[12]范瑞祥,孙旻,沈斐,涂春鸣.基于限值判断的DSTATCOM分频协调控制方法[J].电力系统自动化,2009,04:67-71+91.
[13]朱媛媛.行政裁量程序控制研究[D].郑州大学,法律,2013,硕士.
[14]邓俊芳.隐孔菌多糖对大鼠变应性鼻炎和鼻黏膜eotaxin mRNA表达的影响[D].浙江大学,免疫学,2004,硕士.
[15]刘春莲.502例高龄骨科手术患者术后并发症影响因素的回顾性研究[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[16]吴世纬.500年的梦想终成现实——记龙王庙从险点变景点[J].武汉文史资料.2002(10)
[17]胡桂兰.创业团队异质性对创业决策的影响研究[D].江苏大学,2013.
[18]张军.CFRP约束锈蚀RC柱的锈胀裂缝发展与粘结性能研究[D].哈尔滨工业大学,结构工程,2013,硕士.
[19]李欣欣.东北老工业基地产业结构变动的能源消费效应研究[D].辽宁大学,统计学,2012,硕士.
[20]肖淞月.森林资源管理信息系统的研究和软件实现[D].北京林业大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[21]朱道政.金属氧化物基复合材料的制备及其性能研究[D].安徽大学,应用化学,2014,硕士.
[22]宋盈.新疆企业商业模式创新研究[D].新疆财经大学,企业管理,2013,硕士.
[23]李莎.合赞汗的经济改革[D].湖南师范大学,世界史,2014,硕士.
[24]盛四清,范林涛,李兴,檀晓林.基于帕累托最优的配电网多目标规划[J].电力系统自动化,2014,15:51-57.
[25]周会琴.医学专科院校校园文化建设实证研究[D].安徽大学,公共管理,2012,硕士.
[26]王利华.纳米白炭黑的制备及性能表征[D].沈阳理工大学,2014.
[27]俞寿朋,蔡希玲.拟合零炮检距剖面与分辨率[J].石油地球物理勘探,1995,02:168-180+291.
[28]杨慧.气流输送式排种系统性能试验研究[D].中国农业机械化科学研究院,农业机械化工程,2014,硕士.
[29]常坤.篮球教学实践中弱侧手技术训练的实验研究[D].南京体育学院,体育教育训练学,2012,硕士.
[30]马艳.《国语》正文训诂研究[D].渤海大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[31]陈洪杰.论我国的个人信息保护模式[D].上海交通大学,法律,2013,硕士.
[32]方瑜.高职院校辅导员队伍专业化、职业化建设研究[D].南昌大学,思想政治教育,2012,硕士.
[33]孙彤瑶.当代语境下的人文地理摄影研究[D].山东师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[34]张然.基于物联网技术的输电设备接地安全防御系统研究[D].华北电力大学,电气工程（专业学位）,2012,硕士.
[35]李继良.基于CAN总线的自卸汽车举升机构控制系统的研究与开发[D].重庆交通大学,车辆工程,2012,硕士.
[36]王荣霖.故乡的桥亭[J].同舟共进.1995(03)
[37]杜宁.中小板市场IPO抑价影响因素研究[D].辽宁大学,会计学,2012,硕士.
[38]张成豪.美国对华网络外交及其对中国的启示[D].华中师范大学,国际政治,2013,硕士.
[39]任旭虎,马帅,赵仁德,许强.基于自适应陷波滤波器的基波与谐波有功功率分别计量[J].电力系统自动化,2011,16:66-70.
[40]薛将.脉冲激光沉积法制备钽掺杂二氧化钛薄膜的研究[D].南京航空航天大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[41]李美茹,王以柔,刘鸿先,林植芳.光照强度调控4种亚热带森林植物叶片的抗氧化能力[J].植物生态学报,2001,04:460-464.
[42]李爱良.我国社会组织管理的问题及创新对策探究[D].华南理工大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[43]郭静.自动谈判的协议及策略问题研究[D].国防科学技术大学,2007.
[44]陈明珠.高中历史教科书中史料运用研究[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[45]刘发军.受弯木构件正常使用极限状态可靠度评估[D].哈尔滨工业大学,结构工程,2013,硕士.
[46]王刚.薄膜充气结构的建模及展开过程仿真分析[D].西安电子科技大学,精密仪器及机械,2012,硕士.
[47]纪晓洋.年轻宫颈癌43例临床分析[D].大连医科大学,妇产科学,2012,硕士.
[48]王金鑫,边馥苓.网格GIS的四重地理空间网格模型[J].武汉大学学报(信息科学版),2005,01:73-76.
[49]丁薇薇.水泥窑协同处置城市污泥技术研究[D].浙江工业大学,2013.
[50]范院琴,　徐　伟,　韩　群,　杨勇歌.随机激励下一类含分数阶阻尼的轮胎的振动响应[J].应用数学和力学,2014,12:.