蜡梅两种分子标记的开发及F_1代杂交群体分离方式的评价

【摘要】蜡梅(Chimonanthuspraecox)是蜡梅科蜡梅属植物,原产于中国的一种观花灌木,栽培历史悠久,历来受到人们的喜爱。蜡梅花期在冬末春初,异花传粉,主要的繁殖方式是种子繁殖,为二倍体植物(2n=22),自然分布的区域大多在中国东南部,其它地区分布较少。纵观蜡梅的研究,主要集中在栽培繁殖、品种分类、种质资源及园林应用等方面,不过近几年,随着分子生物学的发展,对蜡梅在分子水平的研究逐渐增多,比如基因克隆、分子标记等方面,这就给蜡梅的研究提供了更大的发展空间。本研究主要利用蜡梅转录组测序库里面的信息,对蜡梅的SSR分子标记和SNP分子标记进行了开发,并利用华中农业大学校园内两株优良单株H29和H64作为亲本构建了一个杂交F1代群体,并在“双假测交”理论的指导下,利用SSR分子标记对此杂交F1群体的分离方式进行了评价,为以后蜡梅的遗传图谱构建打下基础。同时利用开发出来的SNP分子标记对华中农业大学校园内随机选取的12份蜡梅材料进行了分析。本研究的主要研究成果如下：1.SSR分子标记的开发以及对杂交F1代群体分离方式的评价借助于蜡梅转录组测序库中关于SSR标记的信息,从中随机挑选出160对引物进行合成,经过对H29和H64基因组DNA的扩增检验,最终挑选出6对扩增条带清晰且具有多态性的条带。优化了SSR-PCR扩增体系,对不同体系、退火温度、不同研磨法提取DNA以及上样量这些因素进行了对比分析,研究结果显示：20μL反应体系中,上下引物(10μmol/L)各1uL、模板DNA(100ng/mo1)、2×PCRMix10μL(东盛科技,3mMMgC12,0.4mMdNTP,0.1UTaqDNA聚合酶),双蒸水补足为最佳体系；退火温度影响扩增结果,针对不同的引物筛选了最适的退火温度；SSR标记扩增程序对模板DNA质量要求不高；上样量在2～4μL/孔时条带均匀清晰,易于谱带识别。利用SSR分子标记技术和筛选出的6对引物,对杂交F1代群体分离方式进行评价。结果显示：扩增出来的SSR标记有35个,其中多态性标记有27个,在a=0.05水平上,有8个标记符合1：1分离比例,占总条带的22.9%,不分离带和偏分离带各12个,占34.3%,而异常分离带3个,占8.6%。2.SNP标记的开发经过比对1000多个SNP信息位点,设计符合要求的CAPS引物,对12个蜡梅材料进行扩增,筛选能够转化成CAPS标记的SNP位点。结果显示：共设计出42对符合要求的引物,最终只有13个SNP位点成功转化成CAPS标记。13条引物对12个蜡梅材料进行扩增和限制性内切酶酶切,分析结果显示：平均杂合度(AveHet)在0.3000～0.5000之间,杂合度较高；香浓信息指数(I)大部分都达到了0.6000以上；而多态性信息含量(PIC)介于0.25和0.5之间,表现出中多态性。对11份蜡梅材料进行聚类分析,11份蜡梅材料明显的被分为两个类群,H29、M、Z23、柳叶蜡梅、亮叶蜡梅聚为一大类,而H64、L1、L2、L3、L4及J1聚为另一类。
【作者】陈玉星；
【导师】陈龙清；
【作者基本信息】华中农业大学，园林植物与观赏园艺，2014，硕士
【关键词】蜡梅；SSR；分离方式；SNP；聚类分析；

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