整合素αvβ6在结肠癌与甲状腺癌中的作用研究

【摘要】第一部分整合素αvβ6在结肠癌细胞化疗耐药中的作用研究研究背景结直肠癌是世界范围内发病率居第三位,致死率居第四位的恶性消化道肿瘤。近年来随着环境污染日益严重和人们饮食结构的变化,结直肠癌的发病率和死亡率逐步上升。目前,手术切除仍然是治疗结直肠癌的主要方式。然而,在可切除的结直肠癌患者中,大约50%患者将会复发,其中绝大部分患者失去再治愈的机会。目前研究认为,Ⅲ期结直肠癌病人术后需全身辅助化疗以消灭体内的微小转移病变,减少肿瘤复发及改善生存。以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为基础的多种化疗方案应用于临床已达30余年,但因原发性或获得性耐药的产生,化疗往往达不到满意效果甚至归于失败。虽然近年不断涌现一批新颖的化疗药物,如伊立替康、奥沙利铂等,耐药性的产生仍是目前结直肠癌化疗领域亟待解决的问题。整合素是细胞表面粘附分子的一种,由α和β两种亚基结合而成,目前已发现由18种α亚基和8种β亚基组成的24种整合素成员。一方面,整合素在胞外连接基质蛋白或相邻细胞,在胞内连接细胞骨架系统,从而构成肿瘤细胞赖以生存发展的空间纽带；另一方面,整合素作为受体可与多种细胞因子结合,从而向细胞内外双向传导生物信息,构成肿瘤细胞感受外界刺激并作出相应反应的的信息枢纽。研究发现,整合素参与了肿瘤化疗耐药过程。在肿瘤耐药株已发现多种整合素亚型表达上调。另外,整合素可能参与了化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡过程。应用各种分子生物学技术,如抗体阻断,siRNA干扰等,阻断整合素与胞外基质及细胞之间的连接,可有效抑制肿瘤细胞的化疗耐药性。整合素成为解决肿瘤化疗耐药的极有潜力的靶向目标。在此基础上,应用微阵列技术分析肿瘤的整合素表型,可以选择最有效的化疗药物或化疗方案,而针对这些表型进行个体化治疗,将具有良好的临床应用前景。整合素αvβ6仅在上皮组织表达,在胚胎形成、组织修复过程及某些癌组织表达增强,而在正常组织和良性肿瘤组织几无表达。我们前期研究发现：αvβ6在结肠癌侵袭转移、胞外基质降解等肿瘤恶性生物学行为发挥重要作用。另外,αvβ6与ERK2之间存在着生理性直接连接,该直接连接对αvβ6在结肠癌发挥调控功能起着关键作用。然而,αvβ6是否在结直肠癌化疗耐药过程发挥作用迄今尚不明确。在上述背景下,本研究拟选择两种结肠癌细胞系SW480和HT-29及结直肠癌化疗代表性药物-5-FU,在细胞水平深入研究αvβ6是否在结肠癌化疗耐药过程发挥作用并探索其作用机制。第一节整合素αvβ6对5-FU作用下结肠癌细胞增殖和凋亡的影响目的研究整合素αvβ6对5-FU诱导的SW480和HT-29结肠癌细胞增殖抑制及凋亡的影响。方法1.SW480结肠癌细胞分为野生组(SW480wild-type)、已稳定转染含p6基因质粒组(SW480(36-transfectant)和转染空白质粒组(SW480Mock-transfectant),分别用流式细胞术、westernblotting实验检测三组细胞αvβ6蛋白的表达情况。2.利用pSIREN-DNR-DsRed-ExpressVector质粒构建p6特异性shRNA表达载体及对照组载体,以脂质体法转染至HT-29结肠癌细胞,分别用流式细胞术、westernblotting实验检钡HT-29wild-type、β6-shRNA、control-shRNA三组细胞αvβ6蛋白的表达情况。3.以不同浓度5-FU(0.2、1、5、25、125μg/mL)作用于SW480和HT-29各组细胞48h,MTT法检测细胞增殖抑制情况,并计算比较IC50。4.以48hIC50浓度的5-FU作用于SW480和HT-29各组细胞48h,Hoechst33258凋亡形态法和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果1.流式细胞术及westernblotting实验均表明,稳定转染含β6基因质粒的SW480细胞(SW480β6-transfectant)显著表达整合素β6,而野生型细胞或转染空白质粒细胞不表达整合素β6,三组细胞整合素αv的表达无明显差异。2.流式细胞术及westernblotting实验均表明,与control-shRNA比较,β6-shRNA可显著降低HT-29细胞整合素p6的表达,但对整合素αv的表达无明显影响。3.MTT实验表明,在不同浓度5-FU作用下,SW480β6-transfectant组细胞存活率均高于SW480wild-type及Mock-transfectant组；在HT-29细胞,p6-shRNA可显著降低5-FU作用下的细胞存活率。4.Hoechst33258凋亡形态法和流式细胞术实验均标明,在不同浓度5-FU作用下,SW480p6-transfectant组细胞凋亡率均低于SW480wild-type及Mock-transfectant组;在HT-29细胞,p6-shRNA可显著提高5-FU作用下的细胞凋亡率。结论及意义本节研究揭示,在结肠癌SW480和HT-29细胞,整合素αvβ6均可保护细胞抑制5-FU诱导的增殖抑制及凋亡从而增强结肠癌细胞的化疗耐药能力,丰富了整合素αvβ6的理论知识,并为结肠癌的靶向治疗或辅助化疗研究提供了确切的理论依据。第二节整合素αvβ6对5-FU诱导的结肠癌细胞线粒体凋亡途径的影响目的研究整合素αvβ6对5-FU诱导的SW480和HT-29结肠癌细胞线粒体凋亡途径的影响。方法1.细胞分组同第一节。2.以48hIC50浓度的5-FU作用于SW480和HT-29各组细胞48h,westernblotting实验检测胞浆cytochromeC表达情况。3.以48hIC50浓度的5-FU作用于SW480和HT-29各组细胞48h,活性检测试剂盒检测caspase-3和caspase-9活性情况。4.以48hIC50浓度的5-FU作用于SW480和HT-29各组细胞48h,westernblotting实验检测Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果1.westernblotting实验表明,在5-FU作用下,SW480三组细胞的胞浆cytochromeC表达均有增强,但β6-transfectant组细胞胞浆cytochromeC增强程度显著低于SW480wild-type及Mock-transfectant组；在HT-29细胞,与wild-type或control-shRNA组比较,β6-shRNA使5-FU介导的胞浆cytochromeC的表达进一步增强。2.活性检测试剂盒实验表明,在5-FU作用下,SW480三组细胞的caspase-3和caspase-9活性均有增强,但β6-transfectant组细胞增强程度显著低于SW480wild-type及Mock-transfectant组；在HT-29细胞,与wild-type或control-shRNA组比较,β6-shRNA使5-FU介导的caspase-3和caspase-9活性增强进一步加剧。3.westernblotting实验表明,在5-FU作用前后,SW480p6-transfectant组细胞Bcl-2表达明显高于wild-type及Mock-transfectant组,而Bax表达低于后二组；在HT-29细胞,与wild-type或control-shRNA组比较,P6-shRNA可显著抑制Bcl-2表达而增强Bax表达,这种现象在5-FU作用前后均可发现。结论及意义本节实验揭示,在结肠癌SW480和HT-29细胞,整合素αvβ6均可有效抑制5-FU诱导的线粒体凋亡途径,包括抑制胞浆cytochromeC水平升高,抑制caspase-3和caspase-9活性增强,上调凋亡调节蛋白Bcl-2表达而下调Bax表达等。本节研究明确了整合素αvβ6抑制5-FU诱导的结肠癌细胞凋亡的具体机制,丰富了整合素αvβ6的理论知识,并为结肠癌的靶向治疗或辅助化疗研究提供了确切的理论依据。第三节整合素αvβ6介导结肠癌化疗耐药的细胞信号通路研究目的研究整合素αvβ6增强SW480和HT-29结肠癌细胞化疗耐药能力的相关细胞信号传导通路。方法1.细胞分组同第一节,westernblotting实验检测各组细胞MAPK信号传导通路关键因子磷酸化／总ERK(p/t-ERK)、磷酸化/总,fNK(p/t-JNK)和磷酸化/总p-p38(p/t-p38)的表达情况。2.细胞分组同第一节,以PD98059阻断ERK/MAPK信号传导通路,以48hIC50浓度的5-FU作用于SW480和HT-29各组细胞48h,MTT实验检测细胞增殖,AnnexinV/PI-流式细胞术检测细胞凋亡。3.SW480结肠癌细胞分为已稳定转染含p6基因质粒组(SW480β6-transfectant)、转染空白质粒组(SW480Mock-transfectant)和转染含β6突变基因质粒组(转染表达的β6蛋白缺失与ERK2的结合位点)(SW480p6Mutant-transfectant);以48hIC50浓度的5-FU作用于SW480各组细胞48h,MTT实验检测细胞增殖,AnnexinV/PI-流式细胞术检测细胞凋亡,westernblotting实验检测凋亡相关分子Bcl-2和Bax表达情况。结果1.westernblotting实验表明,转染表达β6可明显增强SW480细胞p-ERK的表达,而β36-shRNA可明显抑制HT-29细胞p-ERK的表达；p6表达对t-ERK、p/t-JNK、p/t-p38的表达无显著影响。2.MTT增殖抑制实验及流式细胞术标明,以PD98059阻断ERK/MAPK信号传导通路,可有效抑制整合素αvβ6介导的结肠癌细胞对5-FU的化疗耐药。3.整合素p6缺失与ERK2的结合位点,可显著抑制整合素αvβ6介导的p-ERK、Bcl-2表达增强及Bax表达降低,有效抑制整合素αvβ6介导的结肠癌细胞对5-FU的化疗耐药。结论及意义本节实验揭示,整合素αvβ6通过ERK/MAPK信号传导通路介导结肠癌SW480和HT-29细胞对5-FU的化疗耐药,并在很大程度上依赖于p6与ERK2的直接结合。本节研究明确了整合素αvβ6介导结肠癌化疗耐药的具体信号传导通路,丰富了整合素αvβ6的理论知识,并为结肠癌的靶向治疗或辅助化疗研究提供了确切的理论依据。第二部分整合素αvβ6在甲状腺组织的表达及与甲状腺癌临床病理特征的关系研究背景甲状腺癌发病率在人类全部癌症不超过2%,但几十年来其发病率一直在上升。目前,大多数甲状腺癌为低度恶性,可用手术治愈的并对放射性碘具有良好的反应性。然而甲状腺癌的诊断治疗仍然存在一些问题。首先,细针抽吸活检(fineneedleaspiration,FNA)是目前甲状腺癌最准确的诊断方法,但多达30%的病例仍然存在诊断困难。原因是许多乳头和滤泡状甲状腺癌在结构上类似于正常甲状腺滤泡组织而使人无法做出确切判断。出于避免遗漏恶性肿瘤的目的,在很多诊断困难情况下往往施行大范围的手术切除,而术后才发现为良性肿瘤。其次,一些甲状腺癌具有侵袭转移倾向,包括淋巴结转移和远处转移,而这一点可能影响患者治疗和预后。例如,占甲状腺癌绝大多数的乳头状癌具有特征性的早期淋巴结转移倾向。有研究表明,甲状腺癌患者年龄45岁以上且合并纵隔或颈部淋巴结转移者,其死亡风险显著增加。在上述情况下,需要寻找一种合适的分子标志物,以增加诊断的准确性和预测甲状腺癌转移潜能。整合素是细胞表面粘附分子的一种,由α和β两种亚基结合而成,目前已发现由18种α亚基和8种β亚基组成的24种整合素成员。一方面,整合素在胞外连接基质蛋白或相邻细胞,在胞内连接细胞骨架系统,从而构成肿瘤细胞赖以生存发展的空间纽带；另一方面,整合素作为受体可与多种细胞因子结合,从而向细胞内外双向传导生物信息,构成肿瘤细胞感受外界刺激并作出相应反应的的信息枢纽。αvβ6属于整合素的一种亚型,仅在上皮组织表达,在胚胎形成、组织修复过程及某些癌组织表达增强,而在正常组织和良性肿瘤组织几无表达。研究发现,αvβ6参与了多种恶性肿瘤侵袭转移、增殖凋亡、肿瘤免疫、EMT等生物学功能。值得注意的是,整合素αvβ6表达与多种肿瘤的临床病理特征及病人预后密切相关。在结肠癌,高表达αvβ6的结肠癌患者,与不表达或低表达者相比,其中位生存期明显缩短；对早期结肠癌患者,高表达β6的患者其5年和10年生存率明显降低。在胃癌,αvβ6的表达与Lauren分型、细胞分化、N分期及TNM分期密切相关。重要的是,αvβ6阳性患者其生存期明显短于αvβ6阴性者。另外,在口腔鳞癌,乳腺癌及卵巢癌等,αvβ6表达与肿瘤的临床病理特征及病人预后的关系也得到研究证实。然而,αvβ6在甲状腺癌的表达情况迄今未明。本研究利用免疫组织化学方法检测了一系列恶性和非恶性的甲状腺组织中αvβ6的表达。此外,我们利用统计学方法研究了αvβ6表达与甲状腺癌患者临床病理特征之间的关系。目的检测整合素αvβ6在各种甲状腺组织中的表达,研究整合素αvβ6与甲状腺癌临床病理特征的关系。方法1.购买含有多种甲状腺组织的微阵列芯片,从齐鲁医院病理科收集甲状腺癌组织标本及病人临床病理信息。在研究之前,所有病例均邀请病理科专家进行确诊。2.免疫组织化学方法检测标本中αvβ6表达情况,并按确定的标准进行评分。3.比较不同甲状腺组织的αvβ6表达差异；研究αvβ6表达与甲状腺癌患者临床病理特征之间的相关性,包括年龄、性别、病理类型、TNM分期等。结果1.整合素αvβ6在不同甲状腺组织的表达存在显著差异。在正常甲状腺组织,癌旁组织,甲状腺腺瘤,整合素αvβ6表达一般为阴性或弱阳性。其中,10例(10/10)正常甲状腺组织均未检测出αvβ6表达,只有1例(1/10)癌旁组织和3例(3/10)甲状腺腺瘤组织αvβ6表达阳性。整合素αvβ6在甲状腺肿组织和甲状腺炎组织多有广泛而较强表达,其中7例(7/10)甲状腺肿组织及8例(8/10)甲状腺炎组织αvβ6表达阳性。在甲状腺癌,有71例(71/90)αvβ6表达阳性。此外,10例(10/10)甲状腺乳头状癌淋巴结转移灶均检测有αvβ6的表达。2.αvβ6表达区别甲状腺癌和非恶性甲状腺组织的灵敏度为78.89%,特异度为62%,预测阳性值为78.89%,而预测值阴性率为62%。检测αvβ6表达可成功区别甲状腺癌与正常甲状腺组织、癌旁正常组织和甲状腺腺瘤,但不能区别甲状腺癌与结节性甲状腺肿和甲状腺炎组织。此外,乳头状甲状腺癌和滤泡状甲状腺癌之间的αvβ6表达无显著差异。3.αvβ6表达与甲状腺癌患者的性别、肿瘤组织学形态、T分期和TNM分期之间无相关性,但和患者的年龄和N分期有相关性。结论及意义本研究表明整合素αvβ6在不同甲状腺组织的表达存在显著差异,检测avβ6表达以区别非恶性甲状腺组织和甲状腺癌具有良好的灵敏度和特异性。此外,整合素avβ6的表达与甲状腺癌淋巴结转移有密切相关性。在这个意义上,检测整合素avβ6的表达可能有助于补充FNA活检以提高诊断的准确性,并帮助预测甲状腺癌潜在的淋巴转移倾向。
【作者】刘松；
【导师】牛军；
【作者基本信息】山东大学，外科学，2014，博士
【关键词】整合素αvβ6；结肠癌；化疗耐药；增殖；凋亡；整合素；线粒体凋亡途径；细胞外信号调节激酶；甲状腺癌；淋巴转移；免疫组织化学；组织微阵列芯片；

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