miR-26b靶向Smad4调控猪卵泡颗粒细胞凋亡的分子机制

【摘要】在雌性哺乳动物中大约有70%-99%的卵泡发生闭锁,而卵巢闭锁的实质就是颗粒细胞凋亡。Smad4是Smad蛋白家族中唯一的一个共介导型Smad,在TGF-β/Smad及BMP/Smad信号通路中起到中心元件的作用。研究发现Smad4在哺乳动物卵巢颗粒细胞的增殖、分化、卵泡发育和繁殖性能等方面发挥重要作用,特异性敲除卵巢Smad4基因后小鼠卵巢异常,表现出严重的卵丘细胞异常和颗粒细胞提早黄体化。最近研究发现miRNAs在哺乳动物卵泡细胞凋亡中起到重要的调控作用,但目前关于猪Smad4基因及其调控miRNAs方面的研究较少。本实验以二花脸猪为研究对象,采用克隆测序技术获得二花脸猪Smad4基因编码区序列；利用生物信息学方法分析其序列特征及蛋白结构；运用RT-PCR技术和免疫组化方法检测Smad4的组织表达特征和卵巢组织细胞表达特征；采用real-timePCR技术和Westernblot技术检测二花脸猪和商品猪卵巢组织中Smad4基因和蛋白表达水平差异；利用RNAi技术分析了Smad4在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用；通过构建Smad4-3’UTR荧光素酶报告载体验证miR-26b是猪Smad4的调控miRNA;采用流式细胞仪、real-timePCR技术和Westernblot技术分析miR-26b靶向Smad4对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用。研究结果为揭示二花脸高繁殖力性状形成的分子机制提供参考和理论依据。本文主要研究结果如下：1.二花脸猪Smad4基因编码区序列分析通过克隆测序获得了二花脸猪Smad4基因编码区序列,全长为1659bp。二花脸猪Smad4基因定位在1号染色体第104431-104486kb之间(GenBank序列号：NC101443.3)。同源性分析发现二花脸猪Smad4基因核苷酸序列与哺乳动物其它物种的一致在86%以上。二花脸猪Smad4基因编码蛋白含552个氨基酸残基,与哺乳动物的一致性在84-98%之间。结构域预测发现二花脸猪Smad4蛋白与哺乳动物其它物种一样,也含有3个保守的结构域,即MH1结构域、SAD结构域和MH2结构域。三级结构预测显示二花脸猪Smad4蛋白含有7个α螺旋、12个β折叠和一些无规则卷曲。以斑马鱼为外类群,构建了哺乳动物NJ系统发育树,发现聚类结果与经典的分类学吻合。研究结果表明二花脸Smad4基因与哺乳动物其它物种在进化上相当保守,推测二花脸猪Smad4基因与其它哺乳动物一样在繁殖力和颗粒细胞凋亡等方面发挥重要作用。2.二花脸猪Smad4基因表达特征与卵巢组织表达水平采用RT-PCR方法检测Smad4基因在二花脸猪小肠、肝脏、脑、心脏、肾脏、脾、子宫和卵巢组织的表达情况,结果发现Smad4基因mRNA在二花脸猪的8种组织中均有表达,说明猪Smad4基因是一个广泛表达的基因。免疫组化分析发现Smad4基因在猪卵泡的各个发育阶段均有表达,主要分布在卵母细胞和颗粒细胞中。real-timePCR检测发现二花脸猪卵巢组织中Smad4基因mRNA表达水平极显著高于杜长大猪(P<0.01).Westernblot检测发现二花脸猪卵巢组织中Smad4蛋白表达水平显著高于杜长大猪(P<0.05)。3.Smad4在猪卵泡颗粒细胞凋亡中的作用用Smad4-siRNA转染猪的卵巢颗粒细胞,转染后48h,利用real-timePCR技术检测Smad4基因的mRNA表达水平,结果发现颗粒细胞中Smad4基因mRNA水平下调了72.44%,差异极显著(P<0.01)；转染72h后,利用westernblot技术检测蛋白水平,结果发现Smad4蛋白水平下降41.67%,差异极显著(P<0.01),说明Smad4-siRNA可有效的抑制猪颗粒细胞中Smad4基因的表达。转染后48h,流式细胞仪检测发现细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；凋亡相关基因Bcl-2mRMA表达量显著下降(P<0.05),但Bax表达量变化不显著,说明抑制Smad4可促进猪卵泡颗粒细胞凋亡。4.miR-26b对猪Smad4基因的靶向调控作用根据生物信息学网站预测,结合课题组前期利用miRNA芯片检测猪卵泡闭锁过程中miRNA表达谱,结果发现miR-26b既是Smad4基因的候选调控miRNAs,也是猪卵泡闭锁过程中差异表达的1miRNA。将miR-26bmimics和构建的smad4基因3’UTR荧光素酶报告基因载体共转染Hela229细胞,转染24h后检测荧光素酶活性,结果发现转染miR-26bmimics后组报告基因的活性极显著低于对照组(mimicsNC组)(P<0.01),说明过表达miR-26b可极显著抑制报告基因的活性,验证了miR-26b对猪Smad4基因具有调控作用,是猪smad4基因的调控miRNA。5.miR-26b靶向Smad4基因对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用离体培养猪卵泡颗粒细胞,利用LipofectamineTMRNAiMAX将miR-26bmimics和阴性对照mimicsNC转染猪卵泡颗粒细胞,48小时后检测Smad4基因mRNA表达水平,结果发现Smad4转录水平下降14.60%,差异极显著(P<0.01)。颗粒细胞中凋亡相关基因Bcl-2基因mRNA表达水平显著下调(P<0.05),但Bax基因表达水平无显著变化。72h后Westernblot检测发现Smad4蛋白表达水平下降80.38%,差异极显著(p<0.01)。48h后流式细胞仪技术检测发现细胞凋亡率显著上升(P<0.05)。研究结果说明miR-26b可以通过靶向Smad4基因调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。
【作者】刘吉英；
【导师】李齐发；
【作者基本信息】南京农业大学，动物遗传育种与繁殖，2013，硕士
【关键词】Smad4；二花脸猪；颗粒细胞凋亡；miR-26b；

【参考文献】
[1]丁楹.宋遗民词的隐逸文化阐释[D].广西师范大学,中国古典文学,2003,硕士.
[2]李志刚.交通荷载作用下含硬壳层软土地基破坏形式及设计方法研究[D].长安大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[3]曹尉青.小型数字程控交换机的设计与实现[D].河北大学,通信与信息系统,2003,硕士.
[4]刘心悦.提升福建省高校科技创新能力的对策研究[D].福建师范大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[5]张秀红.西安市体育健身休闲娱乐产业政策研究[D].西安体育学院,体育人文社会学,2013,硕士.
[6]杨丹.植物自然形态构造对现代设计的启迪[D].沈阳师范大学,美术学,2013,硕士.
[7]许文静.浅析企业说明会的口译实践[D].吉林华桥外国语学院,日语口译（专业学位）,2014,硕士.
[8]汪震龙.基于复杂系统动态贝叶斯模型的我国上市公司资本结构影响因素的研究[D].厦门大学,统计学,2014,硕士.
[9]张文倩.视频监控中人群密度估计研究[D].中北大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[10]汪清静.不等向固结条件下砂土动力特性及强度归一化表征[D].浙江大学,土木工程,2012,硕士.
[11]董欢秋.论黄蓓佳儿童小说的创作特色[D].浙江大学,现当代文学,2012,硕士.
[12]高文坚.高中政治学科研究性学习中问题意识的培养[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[13]付银萍.初中级阶段泰国学生汉语连谓句习得偏误分析[D].广西民族大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[14]张立亨.基于利益相关者的财务会计报告模式研究[D].山东大学,会计（专业学位）,2013,硕士.
[15]张丙坤.南海北部深水区天然气水合物相关活动构造类型及成因机制[D].中国海洋大学,海洋地质,2014,博士.
[16]沐连顺,范建忠,李蓓.IEC61850标准中ACSI的原型设计与实现[J].电力系统自动化,2006,03:71-75.
[17]章圣闯.基于B/S模式的小型连锁商店管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[18]杨本坤.肉桂酸在大鼠体内的药动学及其吸收分布特性研究[D].广东药学院,药剂学,2013,硕士.
[19]吴启美,周启星.大金发藓对土壤多氯联苯污染的生理生态响应[J].植物生态学报,2015,03:275-282.
[20]彭元萍.汽车钣金件压力连接质量监控系统的研究与开发[D].华南理工大学,车辆工程,2014,硕士.
[21]袁建武.资本市场对货币政策的影响[D].湖南大学,金融学,2003,硕士.
[22]周超.岩石—土壤—植物成矿元素运移的光谱响应及其应用研究[D].吉林大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[23]赵光军.拮抗菌的筛选及其对无乳链球菌粘附罗非鱼粘液的拮抗作用研究[D].海南大学,水产养殖学,2014,硕士.
[24]李海欧.西部山区高速公路建设管理模式与科技绩效评价研究[D].吉林大学,交通运输工程,2013,硕士.
[25]迟尚忠.浅议原油调节阀流量系数的计算[J].油田地面工程.1991(06)
[26]钱铁云,王元珍,冯小年.利用prefix-hash-tree实现从中文文本到事务数据的转换[J].计算机科学,2005,05:167-169+184.
[27]唐东平,王晓玉.基于数据仓库的医药行业企业信息门户[J].华南理工大学学报(自然科学版),2003,07:10-14+18.
[28]刘吉洋,郭少军,翟月明,李丹,汪尔康.肉豆蔻酰磷脂酰甘油保护石墨烯的制备[A].中国化学会.中国化学会第27届学术年会第09分会场摘要集[C].中国化学会:,2010:1.
[29]杨明,孙志挥.基于前缀广义链表的快速关联规则挖掘算法[J].小型微型计算机系统,2003,05:899-901.
[30]贾强乐.带动力的模块式液压平板运输车电气控制系统设计[D].燕山大学,控制工程,2012,硕士.
[31]葛宝金,王连俊,李丹枫,李懿.大秦重载铁路路基基床表层静力学性能及状态[J].北京交通大学学报,2014,04:143-147.
[32]周东君,王正肖,张卫,叶建芳,吴鹏程,潘晓弘.基于携因素语义距离的定制西服订单聚类方法[J].计算机集成制造系统.
[33]吴宪贞.学术文化视野中的《庄子》思辩之风[D].曲阜师范大学,中国古代文学,2004,硕士.
[34]陈明珠.高中历史教科书中史料运用研究[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[35]杨隽.结构动力学鲁棒设计方法及应用[D].南京航空航天大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[36]李伦.社区居家养老中老年人照顾者的弱能探究[D].复旦大学,社会学,2012,硕士.
[37]郭朝红.素质教育社会评价初探[D].华东师范大学,教育经济与管理,2001,硕士.
[38]曹锐.液相色谱串联质谱联用技术鉴定小鼠肝脏和大鼠海马组织质膜蛋白质[D].湖南师范大学,生物化学与分子生物学,2004,硕士.
[39]孙浩亮.专利质押价值评估参数研究[D].天津财经大学,会计学,2012,硕士.
[40]郭庆来,孙宏斌,张伯明,吴文传.基于无功源控制空间聚类分析的无功电压分区[J].电力系统自动化,2005,10:36-40+54.
[41]丁巍.促进学习者沉浸体验的数字化教育游戏的设计策略研究[D].东北师范大学,教育技术学,2012,硕士.
[42]刘江豫.河南不同产区烤烟质量指标相关性分析[D].湖南农业大学,作物,2012,硕士.
[43]刘雪飞.马克思主义哲学教育原则探析[D].新疆师范大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[44]王珂.以讲话为指导,搞好高校科技成果的转化[J].研究与发展管理.1992(03)
[45]李继森.聚酯丙烯酸酯杂化多元醇水分散体的制备[D].湖南大学,化学工程与技术,2012,硕士.
[46]孙丽.Web数据的挖掘方法研究[D].大庆石油学院,计算机应用技术,2004,硕士.
[47]赵汝文,陈智钊,金伯英,杜英生,余国琮.碳钢渗铝孔板波纹填料的性能及其在石油化工工业中的应用[J].石油化工设备.1991(02)
[48]雷漫飞.农家不乐：对龙湾村旅游发展的人类学反思[D].宁夏大学,民族学,2014,硕士.
[49]李志杰.中美两国在对方全国民调中的形象研究[D].北京外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[50]张丽华,潘保芝,单刚义,何丽.火山岩储层流体性质识别[J].石油地球物理勘探,2008,06:728-730+611-612+742.