整合素αvβ6在SDF-1/CXCR4介导的结肠癌肝转移中的作用及分子机制研究

整合素αvβ6在SDF-1/CXCR4介导的结肠癌肝转移中的作用及分子机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-08-05 分类:期刊论文 喜欢:3124
师大云端图书馆

【摘要】研究背景和意义结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,发病率逐年上升且死亡率居高不下,严重危害着人民群众的健康,成为世界肿瘤研究领域的一大难题。结肠癌的侵袭转移是影响其预后的主要因素,表现出明显的组织器官特异性,肝、肺、淋巴结是其主要转移部位,其中肝转移最为常见,是导致结肠癌患者死亡的主要原因。传统观点认为结肠癌细胞经门静脉回流肝脏时运动变慢,容易在此停留和生长。但近年来越来越多的研究表明,这一现象并不能单纯由解剖结构和血液、淋巴引流来解释,应该还有其他因素参与,但这些因素及其具体机制目前还不清楚。趋化因子是一类具有趋化作用的小分子量细胞因子,其相应受体为G蛋白偶联的7次跨膜受体,二者的相互作用可以介导多种免疫细胞(如淋巴细胞、树突状细胞等)循其浓度梯度做定向迁移,在组织发育、淋巴归巢、机体免疫、炎症反应等诸多过程中发挥重要作用。随着研究的不断深入,越来越多的证据表明趋化因子及其受体与肿瘤细胞的侵袭转移存在密切关系。趋化因子及其受体在肿瘤器官选择性转移中的作用机制类似于其介导的免疫细胞向淋巴组织的归巢过程,即趋化因子与其受体结合后,肿瘤细胞运动能力增强,并循趋化因子浓度梯度向趋化因子富集器官做定向运动,最终完成肿瘤的定向转移。CXCR4是肿瘤细胞中表达最普遍的趋化因子受体之一,在结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中均有较高的表达率,趋化因子SDF-1是其唯一配体,二者相互作用构成SDF-1/CXCR4生物轴在肿瘤细胞的定向迁移过程中发挥重要作用。而且肝、肺、淋巴结等结肠癌好发转移部位均为SDF-1表达丰富的器官组织,提示SDF-1/CXCR4在结肠癌器官特异性转移中具有重要作用,然而其具体作用机制仍不清楚。结肠癌的组织器官特异性转移是一个多步骤的复杂过程。一方面,结肠癌细胞的定向转移需要有一定的“方向性”。而SDF-1的浓度梯度可以为其提供“方向导航”,即CXCR4阳性的结肠癌细胞可以循着SDF-1的浓度梯度,向富含SDF-1的组织器官定向迁移;另一方面,结肠癌细胞的定向转移需要一定的“动力”。既往研究表明SDF-1/CXCR4本身并不直接参与细胞的粘附及迁移运动,而可能通过向细胞内转导信号,激活其他分子,促进细胞的迁移粘附。因此我们认为,与细胞迁移、粘附直接相关的粘附分子可能在其中发挥关键作用。整合素属于细胞表面粘附分子家族,是一类由α亚基和p亚基以非共价键结合组成的跨膜糖蛋白受体。整合素可以介导细胞间及细胞与细胞外基质的粘附反应,通过向细胞内外传导生物学信号,调控细胞的生物学行为。整合素αvβ6是一类仅存在于上皮源性恶性肿瘤的特殊整合素亚型,与多种上皮性肿瘤的发生发展和侵袭转移密切相关,而其作为一种抗恶性上皮性肿瘤的靶目标,已成为该领域的研究热点之一。课题组通过十余年的系统研究表明:整合素αvβ6与结肠癌和胃癌的病理类型、分化程度和病理分期密切相关,可作为结肠癌和胃癌的独立不良预后指标;αvβ6与ERK之间存在直接连接,结肠癌细胞通过αvβ6-ERK信号通路调控uPA、MMP-9和MMP-2的分泌及活性,激活纤溶酶原系统降解细胞外基质,使肿瘤细胞获得高侵袭性表型;在结肠癌细胞中,整合素αvβ6持续的进行内吞胞吐循环,而αvβ6正是通过自身的内吞胞吐循环,直接参与肿瘤细胞的迁移运动。由此可见,SDF-1/CXCR4介导的结肠癌定向转移是多因素相互作用的结果,而目前关于其作用机制的研究多局限于SDF-1/CXCR4生物轴本身及其下游信号通路,SDF-1/CXCR4与其他分子特别是粘附分子相互作用的研究则很少,尤其与结肠癌转移密切相关的αvβ6在其中的作用目前更是未见相关研究。本项目拟通过临床标本和细胞实验,明确CXCR4和avβ6在结肠癌组织和不同转移潜能的结肠癌细胞中的表达情况及其与结肠癌临床病理特征特别是器官特异性转移的关系,分析二者之间的表达相关性,并在此基础上进一步探讨αvβ6在SDF-1/CXCR4介导的结肠癌定向转移中的可能作用及具体分子机制,从而为解释结肠癌细胞的肝脏特异性转移提供一种新型的理论机制。如能在这一新型调节机制中找到一个或多个关键作用靶点,进行针对性干预,将会有效减少结肠癌的远处转移,改善患者预后,对于结肠癌的综合治疗具有十分重要的实际意义和临床应用前景。第一部分αvβ6和CXCR4在结肠癌组织及结肠癌细胞中的表达情况目的明确整合素αvβ6和CXCR4对结肠癌肝转移的影响及二者表达情况的相关性。方法收集2005年~2008年间在山东大学齐鲁医院由同一手术团队行结肠癌根治术的结肠癌患者结肠癌组织及肝转移组织标本,并进行相关资料的采集和随访;资料采集内容包括:性别和年龄等一般资料,肿瘤大小、病理类型、分化程度,TNM分期,手术方式,以及脏器和淋巴结转移等预后情况;然后利用免疫组织化学方法检测病理组织中αvβ6、CXCR4的表达部位、阳性表达率及表达强度,并进行免疫组化评分;在此基础上结合相关临床随访资料,统计分析avβ6和CXCR4在结肠癌组织和肝转移组织中的表达情况及其对肝转移等结肠癌预后情况的影响;并进一步利用Mann-Whitneytest和Spearman等级相关分析等统计方法初步探讨αvβ6和CXCR4的表达相关性。选取高转移潜能的结肠癌细胞系HT-29和WiDr以及非转移性结肠癌细胞系Caco-2作为研究对象;逆转录PCR(RT-PCR)检测β6亚基和CXCR4在各细胞系中的mRNA表达水平;Westernblot检测β6亚基和CXCR4在各细胞系中的蛋白表达水平;流式细胞术检测整合素αvβ6和CXCR4在各细胞表面的表达情况。结果159例符合要求的结肠癌患者被纳入本研究,共收集了159例原发结肠癌组织和21例肝转移组织。通过对159例原发结肠癌组织进行免疫组化检测发现,CXCR4和avβ6分别在在107例(67.3%)和73例(45.9%)结肠癌组织中表达阳性,而二者在正常结肠组织中几乎无表达;通过对21例肝转移组织进行免疫组化检测发现,CXCR4和βvβ6分别在19例(90.5%)和16例(76.2%)肝转移组织中表达阳性,而二者在正常肝脏组织中几乎无表达;CXCR4表达与结肠癌的淋巴结转移(p<0.05)、TNM分期p<0.05)和肝转移p<0.01)密切相关;avβ6表达与结肠癌的淋巴结转移(p<0.05)、TNM分期(p<0.05)、淋巴血管侵犯((p<0.05)和肝转移密切(p<0.01)相关;αvβ6和CXCR4均高表达的患者,与二者表达情况的其他组合相比,更容易出现淋巴结转移(p<0.05)和肝脏转移(p<0.01);Mann-Whitneytest和Spearman等级相关分析表明,αvβ6和CXCR4的表达呈正相关性。细胞实验表明,p6亚基和CXCR4的mRNA和蛋白表达水平在HT-29和WiDr细胞系中均相对较高,而在Caco-2细胞系中的表达水平很低;整合素αvβ6和CXCIR4在HT-29和WiDr细胞表面的表达水平相对较高,而在Caco-2细胞表面几乎无表达或表达较低。结论整合素αvβ6和CXCR4与结肠癌的肝转移密切相关,且二者的表达具有一定的相关性。二者均在高转移潜能的结肠癌细胞中高表达,而在非转移性的细胞中低表达,而且二者均高表达的患者更容易发生肝转移。意义该部分证实了整合素avβ6和CXCR4与结肠癌肝转移的密切关系,为进一步探讨αvβ6和CXCR4参与结肠癌肝转移的具体机制奠定了实验基础并提供了一定的理论前提。第二部分SDF-1/CXCR4对αvβ6及其他整合素表达的影响目的探讨SDF-1/CXCR4对αvβ6及其他常见整合素表达的影响及其具体机制。方法利用实时定量PCR、westernblot检测SDF-1/CXCR4对HT-29和WiDr细胞中av、β1、β3、(35和β6亚基表达的影响;流式细胞术检测SDF-1/CXCR4对细胞表面αvβ6表达的影响;westernblot检测SDF-1/CXCR4对ERK1/2磷酸化的影响,并观察ERK抑制剂U0126对αvβ6表达和HT-29细胞定向迁移的影响;westernblot、共聚焦显微镜检测SDF-1/CXCR4对Ets-1活化的影响,并观察Ets-1特异性siRNA对αvβ6表达和HT-29细胞定向迁移的影响。结果实时定量PCR、westernblot结果表明SDF-1/CXCR4在HT-29和WiDr细胞中可明显增加β6亚基的表达、轻度增加β1亚基的表达,而对αv、β3、β5亚基的表达无影响;流式细胞术显示SDF-1/CXCR4可明显增加HT-29和WiDr细胞表面αvβ6的表达;SDF-1/CXCR4可促进ERK1/2的磷酸化,而ERK抑制剂U0126则可显著抑制SDF-1/CXCR4介导的αvβ6表达上调和HT-29细胞定向迁移;SDF-1/CXCR4可促进Ets-1的活化,而Ets-1特异性siRNA则可显著抑制SDF-1/CXCR4介导的αvβ6表达上调和HT-29细胞定向迁移。结论SDF-1/CXCR4可通过ERK-Ets-1通路促进整合素αvβ6的表达增加。意义明确了SDF-1/CXCR4对αvβ6表达的影响及具体机制,从而为下一步明确αvβ6在SDF-1/CXCR4介导的定向转移和侵袭中的作用奠定了基础。第三部分αvβ6在SDF-1/CXCR4介导的结肠癌细胞定向迁移中的作用目的明确整合素αvβ6在SDF-1/CXCR4介导的结肠癌细胞定向迁移中的作用。方法在Transwell小室的下室加入一定浓度的SDF-1作为趋化物,分别检测HT-29和WiDr细胞在纤连蛋白表面的定向迁移能力;对HT-29和WiDr细胞分别给予三种干预手段,即αvβ6功能阻断抗体10D5、αvβ6特异性siRNA以及CXCR4特异性阻断剂AMD3100,观察各干预手段对结肠癌细胞定向迁移能力的影响。CXCR4过表达质粒pcDNA-CXCR4转染非转移性细胞系Caco-2;利用含绿色荧光蛋白的表达质粒pcDNA-GFP验证转染效率,利用westernblot和流式细胞术验证CXCR4的过表达效果;200ng/mlSDF-1刺激转染了pcDNA-CXCR4的Caco-2细胞,利用实时定量PCR、westernblot和流式细胞术检测SDF-1对αvβ6表达的影响;迁移实验检测过表达CXCR4对Caco-2细胞定向迁移能力的影响,并通过干扰αvβ6观察αvβ6在此过程中的作用。结果与对照组(Transwell小室的下室不加趋化物SDF-1)相比,SDF-1能明显增加HT-29和WiDr细胞在纤连蛋白表面的定向迁移能力;10D5、αvβ6特异性siRNA、AMD3100可显著抑制SDF-1诱导的定向迁移。pcDNA的转染效率大于80%,pcDNA-CXCR4可有效增加Caco-2细胞中CXCR4的表达水平;SDF-1可明显上调转染pcDNA-CXCR4的Caco-2细胞中αvβ6的表达,而CXCR4特异性抑制剂AMD3100可有效抑制SDF-1诱导的avβ6表达上调;过表达CXCR4可显著增加Caco-2细胞的定向迁移能力,而同时应用αvβ6功能阻断抗体10D5则可有效抑制Caco-2细胞定向迁移能力的增加。结论SDF-1可显著增加HT-29和WiDr细胞的定向迁移能力,而αvβ6是这一过程所必需的。而非转移性结肠癌细胞系Caco-2在过表达CXCR4后,可通过上调αvβ6表达而获得较高的定向迁移能力。意义进一步明确了SDF-1/CXCR4可通过上调αvβ6表达促进结肠癌细胞的定向转移。
【作者】王奔;
【导师】牛军;
【作者基本信息】山东大学,外科学,2014,博士
【关键词】整合素αvβ6;CXCR4;结肠癌;肝转移;SDF-1/CXCR4;ERK;Ets-1;SDF-1;定向迁移;

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