基于诊断治疗学多功能纳米系统用于肝细胞癌的分子诊断与治疗

【摘要】肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,化学治疗是临床上主要的治疗手段之一。目前,化疗常常遇到以下两个难题：①治疗方式非个体化,所有病人基于群体通用剂量给药,会因病人个体差异等因素产生超敏或无效现象,导致用药失败；②疗效评估往往在一个治疗周期之后,具有时间滞后性,从而错过了使治疗最佳时机。诊断治疗学(Theranostics)是一种将分子诊断与分子治疗相结合的治疗策略,近年来作为一种新型疾病治疗策略,特别是在肿瘤治疗方面受到了人们广泛的关注。基于诊断治疗学的治疗模式能够实现①可视化药物体内递送过程；②可视化药物在给药靶部位的分布和释放过程；③在治疗的同时进行诊断,实现肿瘤治疗的实时监控和个体化给药等。因此,诊断治疗学对HCC治疗过程中治疗效果的实时监控、及时调整给药剂量或治疗方案、实现病人个体化给药并提高肿瘤治疗效果具有重要意义。本课题基于Theranostics理论,设计和制备一种多功能纳米载体用于HCC的个体化给药,以提高治疗效果,降低毒副作用。首先,选择聚合物纳米粒作为Theranostics载体,设计合成具有载药、长循环和方便后期修饰的多功能材料聚乳酸-聚乙二醇-聚赖氨酸(poly(lacticacid)-Poly(ethyleneglycol)-Polylysine,PLA-PEG-PLL),具有pH敏感性和长循环性的多功能材料聚组氨酸-聚乙醇-生物素(Polyhistidine-Poly(ethyleneglycol)-Biotin,PLH-PEG-Biotin);然后,选取紫杉醇(Paclitaxel,PTX)和索拉菲尼为治疗HCC的模型药物,基于钆(Gd)的磁共振显影(MagneticResonanceImaging,MRI)模式为诊断手段,分别以肿瘤微环境高表达的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)和血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)为靶点,自组装手段制备了三种多功能聚合物纳米载体,分别为：①靶向治疗学多功能纳米粒(靶向VEGF载PTX聚合物纳米粒,TargetPTX-loadednanoparticles,TPN)、②诊断治疗学多功能纳米粒(靶向AFP载Gd/PTX聚合物纳米粒,TargetGd/PTX-loadednanoparticles,TGPN)和③pH敏感诊断治疗学多功能纳米粒(pH敏感靶向VEGFR载Gd/PTX聚合物纳米粒,TargetpH-sensitivetheranosticnanoparticles,TPTN);最后,分别对三种多功能纳米载体的理化性质、体外释放行为、细胞毒性、细胞摄取、体外MRI性质、体内MRI性质、体内抑瘤性质和组织安全性等进行评价,以期提高HCC的分子靶向治疗和治疗监控效果,实现HCC病人个体化治疗。课题主要研究方法与结果如下：1.多功能材料的合成与表征为构建多功能诊断治疗学聚合物纳米载体,课题首创聚合物缀合技术,合成两种新型多功能高分子材料PLA-PEG-PLL和PLH-PEG-Biotin。聚合物缀合技术是指利用化学反应,将具不同功能的单嵌段材料化学连接得到多嵌段多功能聚合物的技术。与传统聚合反应方法比较,该方法合成过程简单,无需严苛的反应条件,产物纯化简单,并能够相对准确地控制每一嵌段的分子量。此外,利用聚合物缀合技术可以将任意具有活性基团的嵌段相连接,具有多嵌段材料制备的可创造性。1.1PLA-PEG-PLL的合成与表征利用酰胺反应,将PLA-COOH分别连接NH2-PEG-NH2得到PLA-PEG-NH2,然后连接PLL(Cbz)-COOH得到PLA-PEG-PLL(Cbz),最后氨基脱保护得到结合载药、长循环和易于修饰多功能于一体的多功能材料PLA-PEG-PLL.通过核磁验证了每一步合成产物的结构。通过凝胶色谱得到PLA,PLA-PEG和PLA-PEG-PLL的数均分子量和多分散系数分别为13691(1.427)、16013(1.277)和20441(1.358)。利用芘荧光探针法测得PLA-PEG-PLL的临界胶束浓度值为7.70×10-3mg/mL(3.76×10-7Mol/L)。基于PLA-PEG-PLL,利用酰胺反应,合成了PLA-PEG-PLL-DTPA和PLA-PEG-PLL-Biotin,分别用于Gd装载和靶向抗体修饰。1.2PLH-PEG-Biotin利用酰胺反应,将Biotin-PEG-NH2与PLH-COOH反应得到PLH-PEG-Biotin,通过核磁验证了合成产物的结构。通过酸碱滴定实验证明PLH-PEG-BiotinpKb值在pH5-7之间,处于血液pH与肿瘤微环境pH之间,具有在肿瘤组织实现纳米粒pH敏感性释药的能力。2.靶向治疗学多功能纳米粒的制备与表征靶向治疗能够提高HCC的治疗效果,降低化疗药物对正常组织的毒性,是目前研究的热点之一。因此,本文首先制备TPN用于HCC的靶向治疗。首先建立PTX高效液相色谱检测方法,PTX在选定液相条件下峰型良好,符合方法学考察要求。利用自组装方法制得TPN外观圆整,呈球形或类球形,粒径为203.6±4.10nm,Zeta电位为20.76±0.34mv,包封率和载药量分别为86.23±1.79%和1.42±0.03%。在体外释放实验中,与Taxol(?)匕较,TPN表现出缓释特性,释放曲线符合Higuchi方程Q=8.0449t1/2-0.5721,R=0.9678.细胞毒性实验结果表明,TPN的细胞毒性(IC50=0.392±0.012μM)显著高于Taxol(?)(IC50=3.554μ0.233μM)和PN(IC50=1.510±0.099μM)(P＜0.01),具有良好的体外抗肿瘤活性。在细胞摄取实验中,FITC标记TPN的摄取具有时间依赖性和浓度依赖性,在不同浓度下,FITC标记TPN的摄取率显著高FITC标记PN(P<0.01)。在体内肿瘤抑制实验中,与NS、Taxol(?)、PN比较,TPN能够显著抑制小鼠体内肿瘤体积的增长(P＜0.01),TPN组生存时间(大于30d)长于Taxol(?)组(23d)和PN(27d),具有良好的体内抗肿瘤活性。以上实验结果表明TPN能够实现HCC的靶向治疗,提高治疗效果,具有重要的应用前景。3.诊断治疗学多功能纳米粒的制备与表征为实现HCC的Theranostics,需要在肿瘤靶向治疗的基础上添加实时诊断模式。课题基于功能集成组装的思路,将Gd的MRI显影模式添加至TPN中,制备TGPN用于HCC的Theranostics研究。利用自组装方法制得TGPN外观圆整,呈球形或类球形,粒径为147.50±4.71nm,Zeta电位为24.45±1.04mv,包封率和载药量分别为88.76±1.64%和1.59±0.06%。在体外释放实验中,与Taxol(?)比较,TGPN表现出缓释特性,释放曲线符合Weibull方程1nln[1/(1-Q/100)]=0.6961nt-6.5891(R=0.9533).在细胞毒性实验中,TGPN在24h的细胞毒性高于Taxol(?)和GPN(P<0.05),具有良好的体外抗肿瘤活性。FITC标记TGPN的细胞摄取具有时间依赖性和浓度依赖性,在AFP阳性HepG2细胞中,孵育0.5h后,FITC标记TGPN的摄取率显著高于FITC标记GPN(P<0.01),在AFP阴性B16细胞中,FITC标记TGPN与FITC标记GPN的摄取率之间没有显著性差异(P>0.05),证明AFP抗体能够促进TGPN在HepG2细胞中的摄取。体外MRI评价表明TGPN具有高弛豫率(25.388mM-1s-1),是马根维显(4.9mM-1s-1)的5.18倍。在体内MRI实验中,给药TGPN后,小鼠肿瘤区域的显影信号增强AUC值为马根维显的87.6倍,信号峰值为马根维显的2.94倍,并能显著延长诊断时间,从马根维显的小于1h延长至6h以上,具有良好的体内MRI诊断能力。与NS、Taxol(?)、比较,TGPN能够显著抑制小鼠体内肿瘤体积的增长(P<0.01),TPN组生存时间(20d)长于Taxol(?)组(11d)和PN(15d),具有良好的体内抗肿瘤活性。以上实验结果表明TGPN具有优秀的HCC诊断和治疗能力,能够实现治疗过程的实时检测,从而利于实现给药个体化,具有重要的应用潜力。4.pH敏感诊断治疗学多功能纳米粒的制备与表征肿瘤组织的定位释药策略能够提高诊断治疗学纳米载体治疗效果和诊断灵敏度,更有利于发挥Theranostics策略优势。因此,本文设计具有pH响应性释药能力的Theranostics纳米粒,制备TPTN用于HCC的诊断治疗研究。首先建立索拉菲尼高效液相色谱检测方法,索拉菲尼在选定的液相条件下峰型良好,符合方法学考察要求。利用自组装方法制得TPTN外观圆整,呈球形或类球形,粒径为181.4±3.4nm,Zeta电位为14.95±0.60mv,包封率和载药量分别为95.02±1.47%和2.38±0.04%。在含10%血清条件下,TPTN在2-4h内粒径保持稳定,证明稳定性良好。在体外释放实验中,TPTN的释放具有pH依赖性,其在pH=5.0的释放介质中释放速率显著高于pH=7.4的释放介质(P<0.01)。在细胞毒性实验中,TPTN在pH=5.0环境中孵育1h后的细胞毒性与索拉菲尼溶液相当,证明TPTN具有良好的体外抗肿瘤活性。FITC标记TPTN的细胞摄取具有时间依赖性和浓度依赖性,在不同浓度下,FITC标记TPTN的摄取率显著高于FITC标记PTN(P＜0.01)。体外MRI评价表明TPTN具有高弛豫率(17.300mM-1s-1),是马根维显(4.9mM-1s-1)的3.53倍。肿瘤模型小鼠静脉给药TPTN后,小鼠肿瘤区域与周围组织之间的信号对比明显,肉眼可以观察到明显的肿瘤边界,并能显著延长诊断时间,从马根维显的小于1h延长至1.5h以上,具有良好的体内MRI诊断能力。在体内肿瘤抑制实验中,与NS、索拉菲尼溶液(口服或静注)、PTN比较,TPTN能够显著抑制小鼠体内肿瘤生长(P<0.01),说明TPTN具有良好的体内抗肿瘤活性。通过组织免疫切片观察,小鼠静脉注射TBN后,各个脏器与注射生理盐水组相应脏器比较没有明显的组织毒性,证明TBN是一个相对安全的载体。以上实验结果表明TPTN在具有优秀的HCC诊断和治疗能力的同时,能够实现药物的肿瘤区域定位释放,进一步提高肿瘤诊断治疗能力,具有重要的研究价值。综上,本研究基于Theranostics理论,设计合成新材料,构建新型多功能聚合物纳米载体,能够同时装载诊断因子和治疗药物,具有被动和主动肿瘤靶向、体内长循环、pH敏感释药等功能,能够实现肿瘤的靶向诊断、靶向治疗和治疗实时监控,为肿瘤Theranostics策略的发展提供了一种新思路和新手段。
【作者】刘永军；
【导师】张娜；
【作者基本信息】山东大学，药剂学，2014，博士
【关键词】诊断治疗学；聚合物缀合技术；多功能纳米粒；功能集成组装；定位释药策略；

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