南蛇藤性别相关分子机制的研究

【摘要】南蛇藤（CelastrusorbiculatusThunb.）是卫矛科（Celastraceae）南蛇藤属（CelastrusL.）落叶藤本植物。本研究以烟台市芝罘区蓁山中的南蛇藤为实验材料，通过观察结果情况和花器官的差异，初步判断南蛇藤性别；采用改良CTAB法提取南蛇藤雌株、雄株及两性株叶片的基因组DNA，构建DNA池；利用RAPD分子标记找出了与南蛇藤性别相关的特异性片段，其中一条雌性性别相关的标记成功转化为SCAR标记，Southern杂交验证了该标记对于南蛇藤性别鉴定的稳定性；对测序结果进行分析，利用RACE技术克隆了南蛇藤脯氨酸脱氢酶基因，并命名为NstProDH1；提取南蛇藤不同组织的RNA，采用荧光定量PCR技术对不同组织中NstProDH1的表达模式进行了分析；对NstProDH1进行了亚细胞定位；诱导该基因的表达，并对脯氨酸脱氢酶的活性进行检测分析；比较了不同组织中脯氨酸含量及脯氨酸脱氢酶的活性差异。主要结果如下：1南蛇藤花期于五月中旬至六月，约20天。根据花器官的差异及结果情况判断南蛇藤的性别，雌株只有雌花，结大量的果实；雄株只有雄花，不结果；雄全同株既有雄花又有两性花，其中两性花结果。2采用改良的CTAB法，提取南蛇藤叶片的基因组DNA，所得到的DNA质量较好，OD值在1.8-2.0之间，没有酚类、多糖及蛋白质的干扰，电泳检测后，发现其条带清晰明亮，无拖尾现象，满足PCR扩增的要求。3对RAPD-PCR影响较大的反应条件底物浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶的量等因素进行优化。最终确定的反应体系为：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（10mmol/L）1μL，引物（20μL/L）1μL，基因组DNA100ng，Taq酶(2.5U/μL）0.5μL，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，36℃退火45sec，72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸10min；最后4℃保存。4利用100个RAPD随机引物对南蛇藤雌、雄及雄全同株的DNA分别进行扩增，经过三次重复，找出南蛇藤不同性别基因组DNA之间存在差异的引物，结果表明，引物111、127、140、148、174在不同性别的DNA中可扩增出差异条带。5将上述存在差异的条带进行切胶回收，并克隆测序，对所得到的序列进行分析，根据其碱基序列，设计一对18-24碱基的特异引物，进行SCAR扩增，最终仅引物111成功转化成SCAR标记，得到一条400bP的差异条带，可作为对南蛇藤进行早期性别鉴定的标记。6对测序得到的序列进行分析，筛选有意义序列进行进一步研究，通过序列比对发现，111引物扩增得到的一条序列可能为脯氨酸脱氢酶的部分序列，我们通过设计引物，进行5’-RACE，得到完整的脯氨酸脱氢酶基因，序列比对显示该基因与拟南芥和烟草的脯氨酸脱氢酶基因具有很高的同源性，将其命名为NstProDH1，通过亚细胞定位，发现该基因编码的蛋白质主要位于线粒体表达。7酶学特性分析表明该酶确实是南蛇藤的脯氨酸脱氢酶；比较该基因在不同器官的转录表达模式和植株脯氨酸脱氢酶活性，结果显示两者之间没有明显的关联，说明该基因的酶活性受到转录和翻译水平的双重调控。
【作者】魏丽娟；
【导师】刘林德；张娟；
【作者基本信息】鲁东大学，生态学，2014，硕士
【关键词】南蛇藤；性别；分子机制；RAPD；SCAR；RACE；南蛇藤脯氨酸脱氢酶；

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