P53 binding protein 1 调控乳腺癌进展转移及化疗敏感性的机制研究

【摘要】研究目的：乳腺癌是严重威胁女性生命健康的最常见恶性肿瘤之一。全球乳腺癌的发病率以每年0.2-8%的幅度上升,每年约有140万人被诊断为乳腺癌,约50万人死于乳腺癌。我国流行病学数据显示,女性乳腺癌的发病率和死亡率也呈逐年递增的趋势,并且发病年龄趋向于年轻化。乳腺癌的生存率与临床分期密切相关,远处转移往往是乳腺癌的致死因素。Macia等研究显示乳腺癌的5年生存率为83.3%,其中Ⅰ期患者5年生存率达97.1%,而Ⅳ期患者仅为24.5%。乳腺癌的发生和进展过程中往往伴随着一系列原癌基因的激活及抑癌基因的失活,这些分子生物学的异常决定着肿瘤的特征,也是其临床进展行为的基础。越来越多的基因已被证实与乳腺癌的进展转移相关,如人类表皮生长因子受体2(Her-2)、Metadherin(MTDH)等原癌基因以及P53、BRCA1等抑癌基因,并且部分基因已经作为分子靶向治疗的位点应用到乳腺癌的临床治疗中。因此,发现决定乳腺癌进展转移和化疗耐药的关键基因将有助于从分子水平上认识乳腺癌,并对其早期诊断和分子靶向治疗的新药研发具有极其重要的意义。P53bindingprotein1(53BP1)是DNA损伤信号传导通路中的重要基因,53BP1缺失的细胞对DNA损伤敏感,其缺失可以增强放疗敏感性已经被充分证实。在导师与国际多家研究机构的研究中,通过分析了176例乳腺癌患者53BP1基因rs560191位点单核苷酸多态性,发现rs560191位点GG基因型与局部高复发率密切相关；通过对504例平均有7.5年随访结果的乳腺癌组织芯片进行免疫组织化学染色发现,约15%的患者表现为53BP1蛋白缺失,而且其缺失与远处转移高风险密切相关。我们这些前期结果均支持53BP1是乳腺癌中一个有重要功能的抑癌基因,但其在乳腺癌中的作用却知之甚少。研究方法及结果：在本课题中,我们拟进一步深入研究53BP1基因在乳腺癌发生发展中的作用,具体内容包括以下三个部分：第一部分53BP1调控乳腺癌进展转移的机制研究研究方法：为了验证53BP1的在乳腺癌进展转移中的作用,我们首先借助WesternBlot技术检测了39对新鲜乳腺癌组织及其配对的癌旁正常乳腺组织中53BP1的表达情况,并对316例乳腺癌发生过程中(乳腺正常组织→不典型增生→原位癌→浸润癌)53BP1的表达量进行免疫组织化学染色,从而验证53BP1在乳腺癌的发生过程中起到重要的作用。随后我们设计了针对53BP1的3个干扰序列,并将其连接到干扰载体pGPU6-Neo-GFP上,然后通过公司测序验证干扰载体的成功构建。53BP1的过表达载体N-Myc-53BP1WTpLPC-Puro为美国洛克菲勒大学TitiadeLange教授赠与。我们将53BP1的干扰载体(shRNA)和过表达载体(53BP1-OVE)及对照载体(Control)用脂质体2000转染到人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7等,分别加入G418和嘌呤霉素筛选得到稳定干扰和过表达53BP1及对应的对照组细胞系,并用Real-timePCR和WesternBlot验证53BP1干扰和过表达的效果。为了检测53BP1对乳腺癌增殖和浸润转移的影响,我们首先用MTT和平板克隆形成的方法分别检测干扰53BP1对MCF-7和T47D、过表达53BP1对MDA-MB-231和MDA-MB-468的增殖和克隆形成的影响,接着用Transwell实验检测53BP1对乳腺癌细胞浸润和转移能力的影响。为了阐明其具体的分子机制,·我们将转染53BP1前后的细胞系,送全基因组microRNA表达谱芯片,筛选出变化最显著的microRNA-146a。通过文献检索和借助miRbase、PicTar和TargetScan等数据库预测microRNA-146a的靶基因为p65,进一步用WesternBlot检测53BP1干扰或过表达前后对NF-kappaB通路的影响。随后对过表达53BP1的MDA-MB-231细胞进行microRNA-146asiRNA的转染,观察NF-kappaB通路的变化,并分析53BP1对增殖和浸润转移的影响。为了进一步证实53BP1对乳腺癌增殖和浸润转移的影响,我们通过裸鼠皮下成瘤模型,观察过表达53BP1前后对裸鼠皮下成瘤能力和生长速度的影响,并对皮下成瘤的组织应用免疫组织化学染色和WesternBlot检测NF-kappaB通路的变化；通过尾静脉注射的肺转移模型观察过表达53BP1前后对肺转移能力的影响。研究结果：临床研究中,我们通过WesternBlot检测新鲜乳腺癌组织及其配对的癌旁正常乳腺组织中53BP1的表达,发现53BP1在癌组织中的表达量明显低于其配对的正常组织。通过对316例乳腺癌不同发生阶段中的组织进行免疫组织化学染色,结果显示53BP1在96.00%的正常乳腺(Normal)组织中表达(48/50,)、在乳腺普通增生(UDH)的组织中表达率也高达90.32%(28/31)、在乳腺不典型增生(ADH)的组织中表达率为64.71%(11/17)、在导管内原位癌(DCIS)组织中的表达率仅为45%(9/29)、而在浸润性导管癌(Cancer)的组织中53BP1的表达率仅为16.40%(31/189)(p<0.05)。细胞学实验中,我们经测序验证53BP1的干扰载体pGPU6-Neo-GFP53BP1shRNA和过表达载体N-Myc-53BP1WTpLPC-Puro的正确性,并在乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468中转染过表达载体,并标记为53BP1-OVE;在MCF-7和T47D细胞中转染干扰载体并标记为shRNA,并通过RealtimePCR和WesternBlot验证了53BP1的干扰或过表达效果良好,可进行下一步实验。首先我们检测了53BP1对乳腺癌增殖和浸润转移的影响。MTT和平板克隆形成显示干扰53BP1的MCF-7和T47D细胞增殖速度加快(MCF-7,P=0.048;T47D,P=0.073)、克隆形成能力明显增强(MCF-7,P=0.007;T47D,P=0.008),过表达53BP1的MDA-MB-231和MDA-MB-468的增殖速度明显降低(MDA-MB-231,P=0.089;MDA-MB-468,P=0.061)、克隆形成能力明显下降(MDA-MB-231,P=0.006;MDA-MB-468,P=0.002)。Transwell结果显示干扰53BP1的MCF-7和T47D细胞的侵袭和迁移能力明显降低、过表达53BP1的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的侵袭和迁移能力增强(P均小于0.0001)。为了研究其具体的分子机制,通过对53BP1干扰和过表达前后的细胞送全基因组microRNA表达谱芯片和Real-timePCR验证,显示microRNA-146a为变化最显著的microRNA。我们通过WesternBlot检测发现53BP1干扰后可激活NF-kappaB通路,诱导P65的核内转录,而过表达53BP1后则抑制了此通路。随后我们对过表达53BP1的MDA-MB-231细胞进行microRNA-146asiRNA的转染,发现其可以逆转53BP1对NF-kappaB通路的抑制作用,并能逆转53BP1对增殖和浸润转移的影响。通过裸鼠皮下成瘤观察干扰或过表达53BP1前后对裸鼠皮下成瘤能力和生长速度的影响,我们发现过表达53BP1后能明显抑制肿瘤的成瘤能力和生长速速(P<0.001),并且与对照组相比,过表达53BP1的肿瘤边界比较清晰,这提示过表达53BP1能抑制肿瘤的侵袭能力；通过对皮下成瘤的组织用免疫组织化学染色和WesternBlot检测NF-kappaB通路的变化,也进一步验证了体外细胞学实验结果。通过对尾静脉注射的肺转移模型观察过表达53BP1前后对肺转移能力的影响,我们发现注射对照组及过表达53BP1的MDA-MB-231细胞5周后,对照组的11只裸鼠的肺组织肉眼和显微镜下均能发现明显的较大转移灶,而过表达53BP1组的仅在显微镜下能看到较小的转移灶。第二部分53BP1抑制乳腺癌血管形成的机制研究研究方法：为了检测53BP1对乳腺癌血管新生的影响,我们通过收集正常传代培养的干扰或过表达53BP1的乳腺癌细胞的上清,分别通过毛细血管形成实验作用于人脐静脉内皮细胞观察53BP1对小管形成能力的影响；通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验观察对血管新生的能力的影响；通过主动脉环实验作用于小鼠主动脉环观察新生血管数目的变化。并选取83例乳腺癌组织进行新生血管标记物CD31、MMP-2和MMP-9免疫组化染色分析53BP1在临床乳腺癌组织中与血管形成的关系。为了阐明53BP1影响血管新生的机制,在干扰53BP1的MCF-7细胞中应用Akt的siRNA后,通过小管形成实验、主动脉环实验和CAM实验验证Akt是否参与了53BP1影响乳腺癌血管新生的影响。并通过对裸鼠皮下成瘤的组织进行CD31的免疫组织化学染色体内验证53BP1对血管形成的影响。研究结果：通过细胞学实验,我们发现干扰53BP1的MCF-7细胞能明显增加其小管形成能力,而过表达53BP1的MDA-MB-231细胞明显抑制其成管能力(MCF-7,P=0.026;MDA-MB-231,P=0.004)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,我们发现干扰53BP1的MCF-7细胞能明显增加血管新生能力,而过表达53BP1的MDA-MB-231细胞明显抑制其能力(MCF-7,P=0.025;MDA-MB-231,P=0.006)。通过主动脉环实验作用于小鼠主动脉环观察新生血管分支变化,我们发现干扰53BP1的MCF-7细胞能明显增加新生血管分支的形成而过表达53BP1的MDA-MB-231细胞明显抑制新生血管分支的形成能力(MCF-7,P=0.002;MDA-MB-231,P=0.008)。为了阐明53BP1影响血管新生的机制,我们用WesternBlot筛选出Akt通路,并在干扰53BP1的MCF-7细胞中转染AktsiRNA后,通过小管形成实验、主动脉环实验和CAM实验发现Akt降低后可逆转干扰53BP1后对乳腺癌血管新生的促进作用。我们进一步借助体内实验验证53BP1对血管新生的影响,通过对裸鼠皮下成瘤的组织进行CD31的免疫组织化学染色,发现干扰53BP1的MCF-7细胞形成的肿瘤中微血管密度的标记物CD31数量明显增多(11.2±4.3vs.27.3±5.9：P<0.001)而过表达53BP1的MDA-MB-231细胞形成的肿瘤中CD31数量减少(21.4±7.8vs.5.1±3.7：P<0.001)。临床研究中我们通过选取83例乳腺癌组织进行新生血管标记物CD31、MMP-2和MMP-9免疫组化染色,结果显示53BP1的高表达与CD31、MMP-2、MMP-9的低表达密切相关(P=0.012、P=0.037、P=0.003),这进一步证实了53BP1对血管新生的影响。第三部分53BP1增强乳腺癌对5-氟尿嘧啶敏感性的机制研究研究方法：为了检测53BP1对乳腺癌化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性的影响,我们首先用MTT检测了不同乳腺癌细胞中53BP1的表达量与5-Fu的敏感性的关系,用免疫荧光法检测了5-Fu处理各个乳腺癌细胞系后53BP1和H2AX的定位。接下来用流式细胞术检测了5-Fu处理53BP1干扰或过表达前后对细胞周期的影响,用WesternBlot检测凋亡相关蛋白Akt、Bcl-2、Bax、P21的变化。为了探讨53BP1影响5-Fu的作用机制,我们检测了转染前后胸苷酸合成酶(TS)和二氢嘧啶脱氢酶(DPYD)的变化,并在干扰53BP1的MCF-7细胞中用TS和DPYD的siRNA验证53BP1对5-Fu的影响。同时通过裸鼠皮下成瘤模型,对单独或同时转染53BP1和应用5-Fu处理后裸鼠成瘤能力和肿瘤生长速度的影响,并对成瘤的组织用TUNEL法检测细胞的凋亡情况进一步验证细胞学实验结果。研究结果：通过MTT检测显示乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和T47D中53BP1的表达量越高,其对5-Fu的反应越敏感,通过用免疫荧光法检测5-Fu处理乳腺癌细胞系后53BP1和H2AX的定位也证实了此结果。通过对干扰或过表达53BP1的细胞用MTT检测其对5-Fu的敏感性,我们发现过表达53BP1可以增强乳腺癌细胞对5-Fu的敏感性,而干扰53BP1的细胞则表现出对5-Fu的耐药性。接下来用流式细胞术检测53BP1干扰或过表达前后细胞周期的变化,发现53BP1可诱导G2/M期的阻滞,用WesternBlot检测凋亡相关蛋白结果显示53BP1可增强促凋亡蛋白Bax和P21、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。通过WesternBlot检测显示干扰53BP1后TS和DPYD升高而过表达53BP1后二者均降低。通过在干扰53BP1的MCF-7细胞中转染TS和DPYD的siRNA发现其可以逆转干扰53BP1后对5-Fu的耐药性。体内试验,通过裸鼠皮下成瘤模型,对单独转染53BP1和同时应用5-Fu处理后裸鼠成瘤能力和肿瘤生长速度的影响,我们发现干扰53BP1后的肿瘤呈现出对5-Fu的耐药性,而过表达53BP1的肿瘤能明显增强5-Fu对肿瘤的抑制作用,并且联合应用过表达53BP1和5-Fu后要明显优于过表达53BP1或者5-Fu的单一作用。体内试验通过对皮下成瘤的组织用TUNEL法检测细胞的凋亡情况,发现53BP1过表达的并用5-Fu处理的MDA-MB-231形成的肿瘤中细胞凋亡明显多于对照组,干扰了53BP1的MCF-7且用5-Fu处理的肿瘤中凋亡的细胞数明显少于对照组。这进一步证实了干扰53BP1能抑制5-Fu诱导的凋亡而过表达53BP1能增强5-Fu诱导的凋亡。结论：1.细胞学实验证实了53BP1对乳腺癌增殖、浸润转移、血管新生的抑制作用及增强化疗敏感性功能。2.动物实验进一步证明53BP1对乳腺癌增殖、浸润转移、血管新生的抑制作用及增强化疗敏感性功能。3.体内外实验阐明53BP1可通过microRNA介导的NF-kappaB通路影响乳腺癌的增殖和浸润转移能力；通过Akt影响血管新生的能力；通过TS和DPYD影响对化疗药物5-Fu的敏感性。4.临床研究验证体内外实验所见,进一步支持了53BP1是一个多功能的抑癌基因。意义：1.揭示了53BP1抑制乳腺癌增殖、浸润转移及血管新生的作用及分子机制；2.阐明了53BP1对乳腺癌化疗敏感性的调节作用及分子机制；3.证实了53BP1在乳腺癌中是一个具有多功能的抑癌基因,为其可作为乳腺癌治疗的新靶标提供了重要的理论依据。
【作者】李小燕；
【导师】杨其峰；
【作者基本信息】山东大学，外科学，2014，博士
【关键词】乳腺癌；53BP1；转移；化疗敏感性；

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