雌激素受体β对乳腺癌细胞耐药及增殖凋亡作用的研究

【摘要】[研究背景]迄今为止,乳腺癌仍旧是全世界女性死亡的首要原因之一。流行病学及实验研究揭示高雌激素水平与乳腺癌发生密切相关。这种关联的一种可能解释是雌激素通过作用于其受体,调控下游抑癌原癌基因表达,促肿瘤发生发展。雌激素受体包含两种亚型,ERa和ERβ。众所周知,ERa对高雌激素所致的乳腺癌有促进作用,而ERβ在乳腺癌中的作用还存在诸多争议。大部分研究称ERβ可负性调节ERα,是预后较好的指标。然而,这些报道都局限在对ERa阳性乳腺癌中所表达的ERβ功能的研究。与此相反,多项调查发现在ERa阴性乳腺癌中,ERβ表达与预后不良的分子亚型呈正相关,比如ERβ可促进癌细胞增生,ERβ在基底细胞样亚型乳腺癌中的表达增多等等。我们知道肿瘤的恶行性转化体现在肿瘤的耐药性增强,增殖速度加快及更容易侵袭和发生远处转移。多药耐药的发生可降低化疗的成功率,增加患者死亡率,逆转肿瘤的多药耐药是十分重要的研究方向。目前,雌激素受体,尤其是ERβ亚型与乳腺癌多药耐药关系的报道还比较少,机制尚不明确。细胞膜耐药蛋白高表达是导致肿瘤多药耐药的重要原因之一。乳腺癌耐药蛋白(BCRP)是耐药蛋白家族中的一员,它的表达可介导米托蒽醌,阿霉素,表柔比星,拓扑替康,甲氨蝶呤,5氟尿嘧啶等多种化疗药物的耐药。由于BCRP广泛表达于多种乳腺癌细胞及乳腺癌组织中,它对于乳腺癌多药耐药的发生有极为重要的意义。我们前期研究发现,BCRP基因的启动子区含有一个雌激素反应元件(ERE),配体-ERα复合物可与之结合,激活经典的基因组通路,调节BCRP的转录表达。因此,我们十分感兴趣是否ERβ对BCRP基因表达也有调控作用。鉴于ERβ在ERα阳性及阴性乳腺癌中的作用报道不一致,我们选取不同分子亚型的乳腺癌细胞系(ERα阳性细胞系MCF-7以及ERα阴性细胞系MDA-MB-453和MDA-MB-468)和169例乳腺癌组织标本(99例ERα阴性标本及70例ERα阳性标本),对其中表达的ERβ在乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的多药耐药和肿瘤生长方面的作用进行研究。[实验方法]应用雌激素及雌激素拮抗剂(TAM或TOR)处理各组细胞,RT-PCR和westernblot法检测各组细胞BCRP基因转录翻译水平的变化。通过米托葸醌外排实验,检测细胞表达的BCRP是否具有泵活性。MTT法检测各组细胞对化疗药的耐药活性。此外,通过EMSA及ChIP实验,证实ERβ调节BCRP基因表达的结合位点。通过分析PCNA蛋白表达及EdU方法,检测ERβ结合不同配体对癌细胞增殖所起的作用；通过观察Caspase-3活化片段生成及AnnexinV/PI双染流式观察ERβ在促细胞凋亡方面的作用。免疫组化染色分析组织样本中ERβ与BCRP,增殖指标(Ki67和肿瘤大小)及侵袭转移的关系。[实验结果]99例ERα/PR阴性乳腺癌标本的免疫组化示ERβ表达与BCRP表达及增殖指标Ki67和肿瘤大小呈正相关。在70例ERα阳性标本中,发现ERβ表达与ERα高表达呈正相关,与BCRP和淋巴结转移呈负相关。体外细胞实验的研究发现,在ERα阴性的乳腺癌细胞系中(MDA-MB-453和MDA-MB-468),生理浓度雌激素作用下,ERp表达促进BCRP的生成,米托葸醌外排显示生成的BCRP具泵活性,导致BCRP介导的耐药增强。MTT进一步检测了细胞在化疗药作用后生存率升高。此外,ERβ表达导致癌细胞中PCNA增殖蛋白合成增多,EdU示ERp高表达组较干扰组及不表达组的增殖细胞比例增多,提示ERp与雌激素作用后刺激癌细胞增生。而在ERa阳性细胞系中(MCF-7),干扰掉ERa后,细胞内源性ERβ与雌激素作用可下调BCRP表达,从而逆转BCRP介导的耐药。与此同时,westernblot检测到Caspase-3活化片段出现,AnnexinV/PI双染显示早期凋亡细胞所占比例增多,提示诱导癌细胞凋亡。进一步干扰掉ERβ后,上述作用不明显。在ERα阴性的乳腺癌细胞系中,雌激素拮抗剂与ERβ作用可逆转雌激素导致的耐药性增强及癌细胞增生的情况；而在ERα阳性细胞系中,雌激素拮抗剂与ERβ结合却会诱导耐药及促癌细胞增殖。传统认为,雌激素拮抗剂是不能单独刺激雌激素受体的,我们的结果却有不同的发现。与此同时,应用EMSA和ChIP技术,证实ERp与其配体复合物是通过结合BCRP基因上游启动子区的雌激素反应元件(ERE),启动经典基因组通路调节BCRP的表达的。[结论]乳腺癌病人治疗中出现的一大障碍,就是化疗中发生的多药耐药。多药耐药的产生通常与细胞膜上高表达ABC转运蛋白密切相关,这种蛋白具泵功能,可将细胞内的底物药物泵出,直接减少胞内药物浓度引发耐药。BCRP作为ABC转运蛋白家族中的一员,涉及多种抗癌药物的自发性和继发性耐药。其中某些药物并不是严格意义上BCRP的底物,却也能发生交叉耐药。尽管BCRP在细胞浆中合成,但它只有转移到胞膜上才有泵功能。因此BCRP在细胞中的定位直接影响其功能活性。本实验免疫组化评分,我们仅将胞膜染色的BCRP视为阳性。先前研究发现激素核受体与BCRP基因表达相关。有报道称,雌激素与ERa结合可通过一种转录后机制下调BCRP的表达。Wang等人则发现,在人胎盘BeWo细胞中,雌激素可下调BCRP,但通过ERβ而非ERa。直到BCRP基因启动子区的结构特征研究明确后,我们发现BCRP启动子区含有雌激素／孕激素反应元件。我们实验组对此进行了大量研究,证实了雌激素-ERa复合物通过结合于BCRP启动子区的雌激素反应元件,上调BCRP的表达：此外,孕激素-PR复合物结合孕激素反应元件后,下调BCRP。然而,ERβ与BCRP的关系至今仍不明确。仅有两篇血脑屏障的文献称,雌激素与ERβ结合后,可通过非基因组通路下调BCRP的表达。鉴于之前关于ERβ作用报道的矛盾不统一,我们将在ERa阳性及阴性的不同类型乳腺癌中,探究ERβ的效用。首先,在ERα/PR均阴性的乳腺癌中,免疫组化结果示有近半数的病例BCRP膜阳性,提示这些病人可能存在BCRP介导的多药耐药。且BCRP阳性与ERβ核阳性呈正相关。同时,我们发现ERβ与Ki67及肿瘤大小也呈正相关,提示ERβ与ERa/PR均阴性乳腺癌细胞的增殖密切相关。而在ERa阳性乳腺癌中,ERα高表达伴随着ERβ表达,且二者都与BCRP及淋巴结转移呈负相关。我们知道在细胞试验中,雌激素与ERa阳性乳腺癌细胞作用促进细胞增殖,转移；而临床病理诊断ERa阳性的乳腺癌细胞分化程度高,预后好。这些结果的矛盾性,是否可用ERβ表达后负性调节ERa,逆转了ERa的促癌作用来解释呢?大部分研究都赞同ERp在ERa阳性乳腺癌中起抑制增殖的作用。此外少数研究报道在ERa阴性的乳腺癌组织中,ERp与增殖指标正相关,这些结果与我们的发现一致。综上,免疫组化结果表明,ERa阴性的乳腺癌组织中,ERβ表达提示与化疗耐药和肿瘤增殖相关。ERα阳性乳腺癌中,ERβ与耐药及淋巴结转移呈负相关。为了深入了解ERβ作用机制,我们构建了不同的细胞模型。对ERa/ERβ/PR均阴性的453细胞,我们外源性过表达ERβ及BCRP(此BCRP的表达由含ERE的启动子启动P-BCRP)。雌激素(E2)处理后,453/ERβ/P-BCRP细胞的BCRP基因RNA及蛋白水平增高,对照组则无改变。上述结果证明BCRP的调控依赖ERβ和雌激素反应元件的同时存在。在内源性表达ERβ和BCRP的ERα阴性的468细胞中,我们再次印证了上述结论。此外,E2结合ERβ上调BCRP的作用可被雌激素拮抗剂三苯氧胺(TAM)抵消。另外,我们还发现内源性和外源性ERβ在雌激素作用下都可促进ERα阴性癌细胞增生,这些结果都与免疫组化结论一致。综上发现,抗雌激素治疗不仅适用于ERa/PR阳性的乳腺癌,也适用于ERa/PR阴性但ERβ阳性的乳腺癌。因此,检测ERa/PR阴性乳癌患者ERβ的表达,对指导内分泌治疗有一定意义。对于ERβ阳性乳腺癌的研究,我们选取了ERa/PR/ERβ阳性的MCF-7细胞系。由于细胞中ERβ表达低于ERα,直接给予雌激素或其拮抗剂,均表现ERa的作用。干扰ERα后,ERβ的作用凸显。ERβ与雌激素作用后下调BCRP表达,效果与ERα相反,也与ERα阴性乳腺癌中ERβ作用相反。并且,我们发现原本起治疗作用的TAM和托瑞米芬(TOR),与ERα阳性乳癌细胞中ERβ结合后,促进了BCRP介导的耐药及癌细胞增生。另外,我们应用EMSA及ChIP在细胞内和细胞外证实ERβ对BCRP的调节作用是通过结合雌激素反应元件,经由经典的基因组通路达成的。综上所述,我们通过分类研究,发现ERβ在ERα阳性和阴性乳腺癌中的作用相反。ERβ在ERα阴性乳腺癌中起促肿瘤作用；而在ERα阳性病例中则负性调节ERα,起抑制肿瘤的作用。ERβ作用的双面性在治疗病人,尤其对选择有效的内分泌治疗有一定的价值。ERβ成为常规乳腺癌指标检测的意义不容忽视。
【作者】李魏玮；
【导师】周庚寅；
【作者基本信息】山东大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】乳腺癌耐药蛋白；多药耐药；雌激素受体β；雌激素反应元件；乳腺癌；细胞增殖；细胞凋亡；

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