miR-195对人脑胶质瘤生物学行为的影响及相关机制的初步研究

【摘要】恶性胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，具有复发率高、致死、致残率高的特点，严重危害着人类的健康。尽管目前国内外治疗胶质瘤采用手术后辅以放疗、替莫唑胺化疗相结合的综合治疗方案，高级别胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤不仅仍然无法治愈，而且中位生存期没有得到显著延长。这与胶质瘤细胞增殖过度、凋亡抵抗、侵袭浸润以及对化疗药物产生耐受的生物学行为特点密切相关。因此，寻找能够有效抑制胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子靶点，对于胶质瘤的治疗具有重要的科学意义和临床应用价值。MicroRNA(miRNA)是一种长约22个核苷酸的内源性小分子非编码RNA，主要通过与目的基因mRNA3’UTR区完全或者不完全结合，实现在转录后水平对基因表达的调控。miRNA的作用方式为“一对多”，与目标基因组成调控网络，参与胚胎发育，细胞增殖凋亡、新生血管生成等多种生物学过程。由于miRNAs的靶基因倾向富集于同一个或某几个信号通路的特点，也使得它对细胞功能和表型的调节更为迅速和有力。miRNA表达还具有时序性、保守性和组织特异性，同时它能够稳定存在于各种体液甚至福尔马林固定的石蜡组织标本（FFPE）中，因此，它越来越成为肿瘤诊断、治疗及预后相关的理想的分子标记物。近期大量研究表明，特异性miRNA的表达异常与胶质瘤细胞的无限增殖、凋亡受阻、侵袭迁移以及化疗耐药等恶性生物学行为调控密切相关。MicroRNA-195（miR-195）是miR-15a/15b/16/195/497家族中的重要一员，基因定位于染色体17p13.1区域，距离抑癌基因P53仅650kb，该区域常发生杂合性缺失。研究显示，miR-195在肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、原发性腹膜癌、膀胱肿瘤等多种恶性肿瘤中广泛下调，通过抑制肿瘤细胞的多种恶性生物学行为，发挥着抑癌基因的作用。但关于miR-195在胶质瘤中的生物学作用及相关机制尚未明确。课题组根据miRNA靶基因数据库miRDB，TargetScan和PicTarpredictions预测和目前国内外已确认的miR-195作用靶点，推测miR-195在调控肿瘤细胞周期G1/S期转换和DNA损伤应答反应中发挥着重要作用，进而影响肿瘤细胞的恶性生物学行为。因此，本研究以miR-195为研究对象，分别检测miR-195在胶质瘤FFPE组织、胶质瘤细胞株及胶质瘤替莫唑胺耐药株中的表达情况，然后通过改变miR-195的表达水平，观察其对胶质瘤细胞增殖凋亡、侵袭迁移、克隆形成、体内成瘤以及耐药等生物学行为的影响，进而结合miRNA靶基因预测数据库的结果，从分子水平研究miR-195影响胶质瘤细胞恶性生物学行为可能的分子机制，这些研究将有助于深入理解miR-195的生物学功能和胶质瘤细胞恶性生物学行为的调控机制，为提高胶质瘤诊疗效果提供新的预测分子和干预靶点，具有重要的理论意义和应用前景。本课题将从三个方面进行研究：1.miR-195在人脑胶质瘤FFPE组织及细胞系中的表达及意义：目的：研究miR-195在人脑胶质瘤福尔马林固定石蜡包埋组织及细胞系中的表达情况，分析其与胶质瘤临床病理分级之间的关系，为进一步探索miR-195在胶质瘤体内外中的生物学作用奠定基础。方法：采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应（qRT-PCR）法检测miR-195在人脑胶质瘤细胞系SHG-44、U87、U251，人星形胶质细胞系，28例不同病理级别人脑胶质瘤福尔马林固定石蜡包埋的组织及2例正常脑组织中的表达情况。结果：（1）qRT-PCR法检测结果显示，与正常人星形胶质细胞（HA）相比，三种细胞株SHG-44、U87、U251中miR-195含量均明显下调，其中SHG-44下调程度最高，而U251下调程度最小，差异具有统计学意义(P<0.05)；28例胶质瘤FFPE组织中miR-195含量均低于正常脑组织，差异有统计学意义（P<0.05）；（2）相关性分析：应用LSD法对四个不同病理级别组进行两两比较，结果显示：Ⅰ级、Ⅱ级之间miR-195表达差别无统计学意义（P>0.05），Ⅰ级、Ⅱ级分别和Ⅲ、Ⅳ级之间差异有统计学意义（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ级miR-195表达高于Ⅰ级、Ⅱ级。Spearman秩相关分析得出miR-195表达与胶质瘤患者的临床病理分级呈负相关（r=-0.798，P＜0.001）。2.miR-195影响人脑胶质瘤细胞增殖凋亡和侵袭迁移能力的体内外研究：目的：观察上调miR-195表达水平对人脑胶质瘤细胞增殖凋亡和侵袭迁移能力的影响。方法：实验分为空白对照组（Blank）组，无义序列组（NC组）和miR-195过表达组（miR-195组）；首先利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将cy5标记的miR-195的模拟物(mimics)、无义序列分别转染入胶质瘤细胞株U251和SHG-44细胞中，激光共聚焦观察转染情况，流式细胞仪检测转染效率并筛选最佳转染浓度；实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法测定miR-195的表达情况；CCK-8法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力；AnnexinV-FITC/PI双染法和Hoechst33342/PI双染法检测细胞凋亡变化；流式细胞仪检测细胞周期；伤痕愈合实验检测细胞迁移能力；Transwell小室检测细胞侵袭能力；免疫细胞化学检测Bcl-2的表达；最后我们进一步评估了过表达miR-195对裸鼠皮下胶质瘤模型生长的影响。结果:（1）miR-195mimics转入到胶质瘤细胞株U251和SHG-44后，在激光共聚焦下观察到较强的红色荧光，流式细胞仪筛选出miR-195mimics最佳转染浓度为50nM，转染效率达90%以上；（2）qRT-PCR结果显示与Blank组相比，U251、SHG-44miR-195组胶质瘤细胞内miR-195含量分别上调9.98、65.97倍（P<0.05）；（3）CCK-8法和平板克隆形成实验结果显示，与NC组和Blank组相比，两种细胞株过表达miR-195后，细胞增殖能力均明显减弱，克隆形成能力降低（P<0.05）；（4）流式细胞仪和Hoechst33342/PI双染法检测细胞凋亡，结果显示与Blank组及NC组相比，miR-195组细胞凋亡和坏死比例明显增高（P<0.05）；（5）伤痕愈合实验结果显示，在U251中，过表达miR-195可以抑制细胞迁移（P<0.05），而在SHG-44中，miR-195组的细胞迁移率与其余两组间差异无统计学意义（P>0.05）；（6）Transwell侵袭实验结果显示，在U251中，过表达miR-195组可以减少穿过Matrigel膜的细胞数（P<0.05），而在SHG-44中，miR-195组穿过Matrigel膜的细胞数多于其余两组（P<0.05）；(7)流式细胞仪检测细胞周期结果显示，与Blank组及NC组相比，miR-195组在G0/G1期细胞明显增加，而S期细胞显著减少（P<0.05）；（8）利用microRNA靶点预测网站及相关生物学信息软件，发现Bcl-2为miR-195的一个靶基因，免疫细胞化学结果显示过表达miR-195可下调Bcl-2的表达；（9）利用裸鼠皮下胶质瘤模型观察miR-195对胶质瘤形成的影响，结果显示miR-195组裸鼠瘤结节出现较晚，生长速度较慢，肿瘤剥离后重量和体积也明显低于NC组和Blank组（P<0.05）；（10）裸鼠肿瘤标本免疫组化分析结果显示，与NC组和Blank组相比，miR-195组Ki67表达下调（P<0.05）。3.miR-195在人脑胶质瘤对替莫唑胺形成耐药中的作用及机制研究：目的：研究miR-195在人脑胶质瘤对替莫唑胺形成耐药中的作用及机制。方法：使用TMZ浓度递增的方法诱导构建胶质瘤耐药株，qRT-PCR法明确胶质瘤耐药株中miR-195的表达变化情况，然后改变耐药株中miR-195的表达水平，CCK-8检测胶质瘤细胞对TMZ耐药性、增殖能力的改变情况；流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化；Westernblot检测MGMT、P21、Bcl-2及CyclinD1的表达；进一步构建裸鼠皮下胶质瘤模型，观察肿瘤生长情况以及对替莫唑胺的敏感性变化。结果：（1）历时6个月成功建立了对TMZ耐药的U251、SHG44耐药株，分别命名为U251R、SHG-44R；（2）qRT-PCR结果显示，胶质瘤TMZ耐药株U251R、SHG-44R中miR-195含量分别下调至亲本细胞的40%、48%，SHG-44R下调更为显著（P<0.05），因此选择SHG-44行后续实验；（3）CCK-8法结果显示上调miR-195增加SHG-44R对TMZ的敏感性，而敲低miR-195则一定程度上增加SHG44R对TMZ的耐药性（P<0.05）；（4）流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示过表达miR-195可明显增加胶质瘤耐药株的总凋亡率（P<0.05），敲低miR-195可略降低总凋亡率，但与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）；（5）细胞周期结果显示上调SHG-44R细胞中的miR-195表达水平，胶质瘤细胞生长减慢，传代时间延长，G0/G1期细胞增加，S期细胞下降（P<0.05），而敲低miR-195对胶质瘤耐药细胞株的细胞周期影响与对照组差异不明显（P>0.05）；（6）Westernblot结果显示过表达miR-195可以下调P21、CyclinD1、Bcl-2的表达，而敲低miR-195后蛋白表达与之相反（P<0.05），MGMT表达水平不受miR-195表达变化影响；（7）裸鼠皮下胶质瘤模型和TUNEL染色结果显示miR-195联合TMZ组抑制胶质瘤生长及促进耐药的胶质瘤细胞凋亡最为显著（P<0.05）。结论:（1）miR-195在所有已检测的胶质瘤FFPE标本及细胞系中均表达下调，并且表达程度与胶质瘤病理分级呈负相关；提示我们可以将其作为胶质瘤I-IV级新的有效的诊断标记物，同时作为常规组织病理学的分级标准的补充；（2）过表达miR-195能够减弱胶质瘤细胞体内外的增殖能力，诱导其G0/G1期阻滞，下调Bcl-2表达，促进胶质瘤细胞凋亡和坏死；但是miR-195对胶质瘤细胞侵袭迁移能力的影响与细胞类型有关，尚需进一步研究；总体上讲，miR-195能够负性调控胶质瘤细胞的恶性生物学行为；（3）miR-195在胶质瘤耐药株中低表达，上调miR-195含量，可以诱导耐药细胞凋亡和增殖受限，下调P21、CyclinD1、Bcl-2的表达，一定程度上恢复体内外胶质瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性，而这一作用与MGMT表达变化无关。综上述，miR-195有望成为胶质瘤基因治疗新的靶点。
【作者】苗旺；
【导师】范益民；
【作者基本信息】山西医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】microRNA-195；胶质瘤；增殖；凋亡；侵袭；迁移；耐药性；

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