p-HDL的AE-HPLC方法检测及其在镰状细胞病中形成机制的相关研究

【摘要】研究背景和目的镰状细胞病(Sicklecelldisease,SCD)是一种常染色体显性遗传血红蛋白(hemoglobin,Hb)病,该疾病以慢性溶血性贫血和持续炎症状态为特征,病程迁延,常合并动脉血管壁增厚、管腔狭窄、血管顺应性以及舒张性能减退等病变,并可引起肺动脉高压。SCD患者的红细胞在循环中易发生破损和单核巨噬系统吞噬而发生溶血,大量释放血红蛋白从而引起自由基释放,产生氧化应激反应；同时,血液黏滞性增加,血流相对缓慢,红细胞变形性差,易堵塞毛细血管引发炎症反应。此前研究表明,SCD患者血浆中血红素(heme)、ROS等促炎分子明显升高,PON1等抗炎介质减少。高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)主要在肝脏合成,过去认为HDL具有抗炎特性,能够促进胆固醇逆转运,对抑制动脉粥样硬化以及预防心血管疾病具有非常重要的作用。近来研究发现,HDL的抗／促炎性质主要与其结合的蛋白密切相关。在体内炎症环境发生变化时,HDL结合的蛋白组分也发生改变,抗炎、抗氧化因子含量降低,白细胞介素、血清淀粉样蛋白A等促炎因子以及脂质过氧化物明显升高,从而促使了HDL从抗炎性到促炎性的转变,其胆固醇逆向转运的功能受到损害,抑制LDL氧化的能力减弱,形成了促炎性高密度脂蛋白(proinflammatory-HDL,p-HDL),从而诱导心血管疾病的发生发展,进而引起血管的病理性改变。研究表明,SCD患者的血浆HpL发生炎性改变,而p-HDL目前已经成为心血管疾病相关临床基础研究的重要靶标之一,测定p-HDL对评价心血管疾病具有重要的意义。因此,仅定量测定HDL已经不能满足临床科研工作的实际需要。对于p-HDL的测定,以往常采用含载脂蛋白B(ApoB)的脂蛋白沉淀法(PrecipitationofApoBcontaininglipoproteins)分离HDL进行检测。首先分离上清液中的HDL,然后利用Dichlorofluorescein(DCFH)方法氧化HDL并检测氧化速率,从而估算p-HDL。虽然ApoB沉淀法分离HDL较为简洁实用,但所分离HDL的上清液中仍含有能够引起HDL氧化的物质,对实验结果造成影响。众所周知,SCD患者镰状细胞破裂引起溶血,细胞外游离的血红蛋白(cell-freehemoglobin,cfHb)以及黄嘌呤氧化酶(Xanthineoxidase,XO)的含量升高。cfHb被大量释放入血液而引起氧化损伤。而XO作为一种强氧化剂,能够增强氧化应激。而血浆白蛋白(albumin)对于氧化应激的影响有双重性,但无论是发挥促进还是抑制作用,都会影响HDL氧化。因此,为明确上清液对p-HDL测定的影响,我们通过阴离子交换高效液相色谱(anionexchange-highperformanceliquidchromatography,AE-HPLC)分析分离纯化SCD患者血浆的HDL,与ApoB沉淀法分离的HDL均进行DCFH氧化并比较p-HDL。同时,在SCD中对于HDL转变为p-HDL的过程所涉及的相关机制目前仍未明确。cfHb明显升高是SCD的主要病理生理过程,同时血浆中的heme也因溶血而大量增加,heme有较强的氧化损伤能力并与Hb具有协同损害作用,从而引发氧化应激反应。我们此前的研究表明,血浆p-HDL水平与cfHb密切相关。SCD患者血浆因镰状红细胞破裂而存在明显溶血,大量cfHb被释放入血,成为影响p-HDL的主要因素。目前已经证实,Hb的清除蛋白结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)和血红素结合蛋白(hemopexin,Hx)能够与Hb紧密结合形成]Hb/Hp/Hx复合体。因此,Hp与Hx作为影响Hb的重要蛋白分子,在Hb与HDL的结合机制中可能具有重要作用。基于上述发现,我们认为SCD患者血浆内cfHb对HDL的炎性转变具有主要影响,并通过探究Hb与HDL结合的相关机制从而为临床干预以逆转HDL的促炎性质提供理论依据。方法第一部分：我们选择来自密尔沃基镰状细胞病研究中心的健康受试者血浆以进行p-HDL的AE-HPLC检测方法的研究。我们通过可吸收光比色法检测血浆总胆固醇、HDL胆固醇(HDLc)以及cfHb。我们分别采用传统的Dextran-MgC12方法以及在本研究设计的AE-HPLC新方法分离HDL。通过分光光度法分析Hb、XO对HDL氧化的影响。为验证我们设计的AE-HPLC分离HDL的优势,我们通过免疫印迹法对HPLC分离的蛋白进行检验。在此基础上,为进一步检测p-HDL,我们将二联柱后反应仪器(Post-ColumnReactor,PCR)与HPLC的阴离子交换柱连接,通过柱后反应系统的双泵分别向液相中泵入DCFH以及Cu2+,与HDL在液相中发生结合,经过荧光检测仪(FluorescenceDetector)检测得出相应的p-HDL峰并进行校正计算。并选取来自密尔沃基镰状细胞病研究中心和威斯康辛医学院的6例SCD患者和6例健康受试者以分析检测结果。我们通过线性回归分析等方法对p-HDL的检测情况进行数据处理,从而对两种HDL分离和p-HDL检测方法进行全面比较。第二部分：我们分别选取来自威斯康辛医学院等多中心的32例SCD患者及28例健康受试者的血浆进行研究。动物实验选择来自威斯康辛医学院的WT、Hp-/-、Hx-/-的SCD患病小鼠和未患病小鼠(n=8)进行研究。我们通过ELISA或免疫沉淀+免疫印迹方法检测ApoA-1及血浆或HDL/ApoA-1结合的Hb,Hp、Hx含量；通过可吸收光比色法进行血脂以及heme、IL-6、IL-10等炎症因子检测；通过荧光探针检测血浆ROS、RNS水平。通过OctetRed多通道蛋白质分子相互作用检测技术分析Hb、Hp、Hx与ApoA-1分子间的相互作用。我们采用第一部分研究所建立的AE-HPLC方法检测各组小鼠的血浆p-HDL水平。通过单核细胞趋化法(monocytechemotaxis,MCA)检测HDL炎症系数,以了解HDL的炎症性质。给予SCD小鼠ApoA-1模拟肽D-4F(10μg/d)4周进行疾病干预。并检测其HDL结合的Hb/Hp/Hx水平、炎症系数、HDL与ApoA-1及Hb的结合能力。结果第一部分：通过紫外分光光度仪检测,我们发现Hb和XO均能够提高HDL的氧化速率。同时,HPLC分析表明,albumin峰与HDL峰发生部分重叠,影响结果分析。因此,去除Hb、XO以及albumin的影响对测定p-HDL是十分必要的。并且,根据不同蛋白阴离子结合能力的差异,对AE-HPLC分离的HDL设置合适的运行流程,分离去除cfHb、albumin及XO。我们的研究结果表明,在SolventB设定比例为18%情况下,HDL与cfHb、albumin及XO均能够实现分离且互不干扰。通过AE-HPLC-PCR方法检测p-HDL发现,SCD患者的血浆p-HDL与对照组相比明显升高。通过对两种HDL分离方法的检测结果进行比较,我们发现HPLC方法测定的p-HDL值明显低于以往采用的ApoB沉淀法,从而证实了黄嘌呤(Xanthine)、XO与能够加速HDL氧化,对p-HDL的检测造成影响。AE-HPLC-PCR方法测定p-HDL可明显减少ApoB方法无法去除的氧化物以提高实验结果的准确性,并能够准确检测SCD对p-HDL升高的影响。第二部分：SCD组患者血浆总胆固醇及HDLc均较对照组有明显减低。SCD患者血浆HDL转变为p-HDL,并且ROS、IL-6及IL-10等促炎因子升高,而抗炎因子PON1降低。通过SandwichELISA方法测定Hb、Hp和Hx,发现这三种蛋白在SCD患者血浆中较对照组存在明显升高。采用线性回归分析进一步证实,HDL内ApoA-1微粒结合的]Hb,Hp和Hx与HDL的炎性以及SCD患者体内的炎症反应强度存在正相关关系,而正常对照组不存在上述线性关系。我们进一步采用免疫沉淀结合免疫印迹方法,证明SCD患者以及相应实验动物模型的HDL所结合的Hb、Hp和Hx明显升高,且发生特异性结合。通过多通道生物分子相互作用系统检测发现,在发生镰状细胞贫血的条件下,血浆HDL借助ApoA-I微粒与Hb、Hp和Hx结合形成复合体。采用MCA法检测各组血浆HDL,我们发现SCD不能改变Hp-/-小鼠HDL的抗炎性质,与普通SCD小鼠相比,Hp-/-患病小鼠HDL结合的Hb含量明显降低,并且Hp-/-小鼠p-HDL水平明显降低。在此基础上,我们使用ApoA-1的模拟肽D-4F进行干预,发现给予D-4F处理后,SCD小鼠血浆HDL恢复抗炎性质(MCA测定结果炎症性质<1),并且HDL结合的Hb、Hp和Hx含量明显减少。结论1.本研究首次通过AE-HPLC方法去除了Hb和XO等相关蛋白对氧化结果的影响,建立了更为准确的p-HDL测定方法,对于评估p-HDL在心血管疾病中的作用具有实际的临床意义。2.通过深入分析引起SCD患者HDL炎性转变的主要因素,阐明了Hp是Hb与HDL结合所必需的蛋白,Hb/Hp途径对于HDL的促炎性转变起到了关键作用。3.利用D-4F能够降低HDL与Hb/Hp/Hx结合能力并对HDL促炎性转变的进行有效干预,提示促使Hb/Hp/Hx的解聚可成为新的治疗靶点。同时,本实验结果对治疗其它血脂异常引起的血管疾病也具有重要意义。
【作者】季翔；
【导师】高海青；KirkwoodA.Pritchard；
【作者基本信息】山东大学，老年医学，2014，博士
【关键词】HPLC；HDL；促炎性转变；镰状细胞病；血红蛋白；

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