shRNA沉默肾癌786-0和OS-RC-2细胞株中HIF-2α的表达对VEGF的影响

【摘要】目的：研究低氧诱导因子2a(hypoxia-induciblefactors-2α,HIF-2α)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)中的表达及临床意义。构建在哺乳动物细胞中表达的低氧诱导因子-2的短发夹RNA的表达质粒,在体外模拟肿瘤常氧和低氧状态下研究对VEGF表达的影响。探讨在786-0和OS-RC-2细胞株中HIF-2a对VEGF的表达影响,HIF-2α可能为肾透明细胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma,CCRCC)潜在的新效靶。方法：选用免疫组织化学方法,检测HIF-2a蛋白和VEGF蛋白的表达,其中76例RCC组织,12例癌旁组织,研究与RCC的相关性。构建HIF-2a的重组载体质粒psiHIV-U6,shRNA-1、2、3、4为重组质粒。转染至786-0细胞,常氧条件培养48h后提取总RNA逆转录cDNA后Realtime-PCR筛选沉默效率最强的shRNA载体质粒。该质粒psiHIV-U6送公司测序鉴定。实验设空白、阴性对照组和实验组即重组质粒组,每组均设常氧组和低氧组,共6组,空白对照组不做任何处理,阴性对照组转染空质粒,实验组转染重组质粒psiHIV-U6,细胞缺氧微环境通过含150umol/L氯化钴(Cocl2)的完全培养基模拟。实时定量PCR分析HIF-2ashRNA重组质粒转染786-0和OS-RC-2细胞后常氧及低氧状态下细胞的HIF-2amRNA表达,流式细胞仪分析凋亡变化,蛋白免疫印迹方法测定VEGF蛋白的变化。实验数据进行了spssl8.2统计学软件处理,计算资料以均值±标准差表示,临床特点指标采用x2检验和秩和检验,Spearman用来等级相关分析,组间比较应用方差分析,以P<0.05有显著性差异。结果:HIF-2α和VEGF在正常肾组织中不表达,而在RCC组织中表达较强。HIF-2α与肿瘤组织的病理类型,病理分级及临床分期有显著相关性,VEGF与肿瘤组织病理分级及临床分期有显著相关性。DNA测序分析证实了重组质粒psiHIV-U6构建成功,在786-0细胞株中shRNA-4沉默HIF-2amRNA的效率最强,shRNA-4可用于后续实验。HIF-2a重组质粒shRNA-4成功转染786-0和OS-RC-2细胞,转染成功的细胞发出绿色荧光,与对照组的细胞形态不同。RT-PCR分析显示：786-0细胞和OS-RC-2细胞中,在阴性对照组中,HIF-2amRNA的表达低氧环境较高。实验组在低氧微环境下HIF-2αmRNA的表达量较高。低氧环境下较常氧环境下HIF-2αmRNA的表达量无明显变化。转染HIF-2αshRNA-4重组质粒在低氧环境下能诱导786-0和OS-RC-2细胞凋亡增加。采用Quantityone软件进行灰度值分析,阴性对照组低氧组VEGF蛋白表达高于常氧组,实验组VEGF蛋白表达量同时下降,且常氧较低氧环境下VEGF蛋白下降显著。结论:HIF-2α和VEGF与肾透明细胞癌的生长密切相关,HIF-2α的研究可能成为治疗CCRCC患者潜在的效靶,为下一步研究提供了基础。
【作者】巩进伟；
【导师】段建敏；
【作者基本信息】兰州大学，外科学，2014，硕士
【关键词】HIF-2α；VEGF；免疫组化；786-0；OS-RC-2细胞；shRNA；肾癌；

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