IGFBP-6对猪体长性状的遗传效应分析及其对细胞增殖作用的初步研究

【摘要】动物的生长发育是一系列复杂而精细的生物代谢过程，这一过程的调控机制一直是国内外的研究热点。西藏小型猪和巴马香猪是我国珍贵的小型猪种质资源，但目前小型猪的生长发育机制及矮小性状形成的机理尚不清楚。在动物生长发育调控系统中，各因素对生长的调节主要是通过神经内分泌生长激素轴（GH-IGF轴）实现的，其中，胰岛素样生长因子结合蛋白6（IGFBP-6）因其结构与功能的特点，以及与胰岛素样生长因子2（IGF-2）较强的亲和力而备受关注。本试验采用实时荧光定量PCR的方法，对不同生长时期的西藏小型猪，巴马香猪和军牧1号白猪的不同组织中IGFBP-6基因mRNA表达水平进行检测，同时，利用直接测序法对西藏小型猪，巴马香猪，军牧1号白猪，东北野猪，大白猪的IGFBP-6基因的启动子区及部分基因序列进行了突变位点的筛查和SNPs位点的连锁分析，并对启动子转录因子结合位点进行了预测和分析，以期分析IGFBP-6基因的表达及SNPs对小型猪体长性状的影响及作用机制。为进一步研究IGFBP-6的作用机制，设计并构建了小鼠IGFBP-6基因的shRNA载体，转染细胞，下调IGFBP-6的表达量，MTT法检测细胞的密度和增殖速率，为构建IGFBP-6转基因小鼠模型奠定基础。对IGFBP-6基因mRNA的表达规律的研究表明：西藏小型猪与巴马香猪同时期不同组织间的分布规律基本一致，而与军牧1号白猪的分布规律存在差异；成年时肝脏中，军牧1号白猪的表达量分别高于西藏小型猪和巴马香猪（p<0.05）；出生时脾脏中，军牧1号白猪的表达量分别高于西藏小型猪和巴马香猪（p<0.01）；表明出生后IGFBP-6基因mRNA的表达在不同体长性状的猪中存在差异。猪IGFBP-6基因启动子区的转录因子结合位点预测发现，IGFBP-6启动子存在一簇Sp1转录因子结合位点，同时，发现启动子区存在GATA-1，GATA-2，Ik-2，NF-kap和SREBP-等转录因子结合位点，表明IGFBP-6可能与癌症的发生和抑制以及脂肪代谢相关。IGFBP-6基因启动子区存在7个SNPs位点，其中-403bp处的A>G转换导致新增加一个c-Myb，野猪-488bp处的T>C转换导致减少了一个AP-1结合位点，新增加一个MZF1结合位点，推测这些转录因子结合位点的改变可能影响IGFBP-6的表达。对SNPs位点的基因型频率分析表明IGFBP-6启动子区的-726bp、-649bp、-403bp和-378bp处的SNPs位点在小型猪与大型猪中的优势等位基因不同，可能与猪体长性状相关。对大白猪，东北野猪，军牧1号白猪连锁分析发现，IGFBP-6基因启动子区-403bp与-378bp两处SNPs位点连锁并且形成三种单倍型，其中，AT型为主要单倍型。在IGFBP-6基因部分序列中检测到6个SNPs位点，其中外显子4的67bp处在小型猪与大型猪中的优势等位基因不同，可能与猪体长性状相关。连锁及单倍型分析发现，在西藏小型猪和巴马香猪中，内含子3的636bp、745bp和外显子4的67bp三个SNPs位点共形成四种单倍型，其中CTT型为主要单倍型。IGFBP-6对细胞增殖作用的研究表明：IGFBP-6表达量下调促进hepa1-6细胞的增殖，在转染后24h的细胞密度比对照组高53.31%。IGFBP-6表达量下调抑制3T3细胞的增殖，在转染后48h的抑制率最高，达到了20.22%。综合以上实验结果，推断IGFBP-6可能是小型猪生长发育调节中的功能基因，是影响小型猪体长性状的候选基因，而其具体的作用机制，尚需进一步研究。本研究为IGFBP-6对小型猪体长性状影响提供了分子依据，为深入研究小型猪生长发育机制奠定了基础，为小型猪资源的开发和应用提供理论依据。
【作者】房希碧；
【导师】刘松财；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】小型猪；IGFBP-6；表达水平；SNP；连锁分析；shRNA；

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