Notch1信号通路在多发性骨髓瘤中的作用及其机制研究

【摘要】多发性骨髓瘤(MultipleMyeloma，MM)是种多发生于中老年人的血液系统恶性肿瘤，目前尚缺乏有效的治疗手段，被视为不可治愈的疾病。常规化疗，患者痛苦大,效果不理想，且易发生耐药；造血干细胞移植费用高，且供体选择有限，由于患者年龄大，往往存在移植风险。近年来，蛋白酶体抑制剂（ProteasomeInhibitors，PIs）如硼替佐米(bortezomib，商品名：Velcade)、Carfilzomib等的出现，对于MM的治疗具有划时代的意义，但多数患者最终产生耐药。因此，深入研究其发病机制并寻找新的高效低毒的抗肿瘤药物或有化疗增敏作用的药物显得十分必要。姜黄素(curcumin，CUR)是从姜科植物如姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的种活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗类风湿、抗肿瘤、抗病原微生物和神经保护等多种药理作用。近年来，关于姜黄素的抗肿瘤作用的研究已成为当今研究的热点。研究表明，姜黄素对多种肿瘤细胞有抑制作用。姜黄素还可以增加肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，对正常的细胞却有化疗和放疗防护作用。Notch信号通路是个较为重要的涉及造血细胞增殖和凋亡的信号转导通路。在哺乳动物中存在notch的四种单跨膜细胞表面受体，notch1是其中之。近来，有报道称，notch1在骨髓瘤细胞中过表达。Notch1能够抑制骨髓瘤细胞凋亡，且能诱导骨髓瘤细胞抗药。故可以把notch1作为个靶点来治疗骨髓瘤。本研究以多发性骨髓瘤细胞为研究对象，着重研究了姜黄素对MM细胞的化疗增敏作用，并对notch1信号通路在其中发挥的作用进行了初步探讨。目的：探讨姜黄素对多发性骨髓瘤细胞的硼替佐米敏感性的影响，以及notch1信号通路在其中发挥的作用。方法：（1）体外培养多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226和KAS-6/1，给予不同浓度姜黄素处理，应用MTT比色法分析细胞增殖；Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，Westernblotting检测细胞中cleavednotch1的表达情况及凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3的表达情况。（2）以四株MM细胞系RPMI8226、OPM2、耐硼替佐米RPMI8226（RPMI8226-V5R）、耐硼替佐米OPM2细胞（OPM2-V5R）和MM患者CD138(+)细胞为研究对象，将姜黄素与硼替佐米联合作用，应用MTT比色法分析细胞增殖；Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，Westernblotting检测细胞中cleavednotch1及凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3的表达情况。（3）以四株MM细胞系和MM患者CD138(+)细胞为研究对象，将notch信号通路抑制剂DAPT与硼替佐米联用，应用MTT比色法分析细胞增殖，Westernblotting检测细胞中cleavednotch1及凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3的表达情况。（4）分别利用靶向Notch1的小干扰RNA（Notch1-siRNA）和无关小干扰RNA（NT-siRNA）转染RPMI8226-V5R和OPM2-V5R细胞，再加入硼替佐米，应用MTT比色法检测细胞活性；westernblotting检测cleavednotch1和cleavedcaspase3蛋白表达情况。结果：（1）姜黄素抑制骨髓瘤RPMI8226细胞和KAS-6/1细胞的增殖，诱导其凋亡；降低cleavednotch1蛋白表达水平，增加cleavedcaspase-3蛋白表达水平，此作用呈剂量依赖性。（2）在MM细胞株及MM病人CD138(+)细胞，各处理组细胞的增殖活性明显低于对照组，姜黄素与硼替佐米联合用药组的细胞增殖活性低于单独用药组；姜黄素、硼替佐米对RPMI8226细胞和OPM2细胞具有明显诱导凋亡的作用，并且它们合用时诱导凋亡的作用更强；姜黄素可加强硼替佐米对cleavednotch1蛋白的抑制作用和对cleavedcaspase3蛋白的促进作用。（3）在四株MM细胞系和MM病人CD138(+)细胞中，各处理组细胞的增殖活性明显低于对照组，DAPT与硼替佐米联合用药组的细胞增殖活性低于单独用药组。DAPT可加强硼替佐米对cleavednotch1蛋白的抑制作用和对cleavedcaspase3蛋白的促进作用。（4）在RPMI8226-V5R和OPM2-V5R细胞中，转染Notch1-siRNA抑制Notch1的表达，可以增强硼替佐米对细胞增殖活性的抑制，同时伴有cleavedcaspase3的表达量明显增加。而转染NT-siRNA组细胞无此效应。结论：姜黄素可以提高MM细胞对硼替佐米的化疗敏感性，该作用与notch1信号通路的抑制有关。多发性骨髓瘤是种浆细胞恶性增生性疾病，伴有进行性溶骨性病变，以骨痛和病理性骨折为临床表现。骨髓瘤骨病的发病机制是不平衡的骨重塑，即破骨细胞形成增多，成骨形成减少。多项研究也已证明，多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞（MesenchymalStemCells,MSCs）中RANKL/OPG表达上调是破骨细胞激活和骨溶解的机制，而成骨生成受抑的机制尚不清楚。MSCs最重要的个特征是多重分化潜能，包括向成骨细胞分化。近来研究表明：源于MM病人的MSCs与正常人的MSCs相比，存在着成骨分化潜能受损。MSCs向成骨细胞分化过程受到抑制是MM中成骨细胞活性降低的部分原因。据报道，骨髓瘤细胞和基质细胞产生的过量的可溶性抑制因子（如IL-3、sFR-2、TNF及Dkk-1）会妨碍成骨细胞的形成和成熟。Notch信号通路是个进化上高度保守的信号通路，可以调控细胞的多种活动，如增殖、分化和凋亡等。在哺乳动物中存在notch的四种单跨膜细胞表面受体，Notch1是其中之。旦与配体发生结合，Notch1就会发生蛋白水解，释放出胞内区（theNotchintracellulardomain,NICD），即cleavednotch1。NICD进入细胞核，与转录因子相互作用，进而激活靶基因的转录。有研究表明，notch1信号通路可以抑制间充质祖细胞的成骨分化潜能，保持其干性。硼替佐米，FDA批准的第代蛋白酶体抑制剂，对初诊的和复发的MM都有较好的疗效。据报道，硼替佐米可以在体内外抑制破骨细胞的活性，增强成骨细胞的活性。Carfilzomib（CFZ），第二代蛋白酶体抑制剂，具有更强的骨髓瘤细胞毒性，相对于硼替佐米来说，副作用更小。除了抗MM作用，CZF还可以增加成骨细胞的形成和活性。有报道称，CFZ能够促进MSCs的成骨分化和钙质沉积。然而，CFZ促进成骨分化的具体机制尚不清楚。在本研究中，我们探讨了CFZ对骨髓瘤患者来源的MSCs（MM-MSCs）向成骨细胞分化的影响及可能机制。目的：探讨MM-MSCs成骨分化潜能和notch1活性的改变及其二者的关系，CFZ对MM-MSCS成骨分化潜能的影响及可能机制。方法：（1）正常对照MSC（sND-MSCs）和MM-MSCs成骨诱导分化2周，Real-timeRT-PCR和Westernblotting检测成骨分化标志物Runx2、OCN、Osx的表达，Vonkossa染色检测钙质沉积，Real-timeRT-PCR和Westernblotting检测成骨诱导前后cleavednotch1和notch1下游信号分子Hes1的变化。（2）MM-MSCs用含notch1抑制剂DAPT(5nM)的成骨诱导培养基培养2周，Real-timeRT-PCR和Westernblotting检测cleavednotch1、Hes1及成骨分化标志物Runx2、OCN、Osx的表达，Vonkossa染色检测钙质沉积。（3）使用含CFZ(2.5nM、5nM)的成骨诱导培养基诱导MM-MSCs，Real-timeRT-PCR和Westernblotting检测cleavednotch1、Hes1及成骨分化标志物Runx2、OCN、Osx的表达，Vonkossa染色检测钙质沉积。结果：（1）与ND-MSCs相比，MM-MSCs中成骨标志物Runx2、OCN、Osx的mRNA和蛋白表达都降低，钙质沉积减少。ND-MSCs经过成骨诱导后，Hes1的mRNA表达量，cleavednotch1和Hes1的蛋白表达量均降低；而MM-MSCs在成骨诱导前后，Hes1的mRNA表达量，cleavednotch1和Hes1的蛋白表达量基本不变。（2）DAPT可以抑制MM-MSCs中Hes1的mRNA和蛋白表达量，以及cleavednotch1的蛋白表达量，同时伴有成骨标志物Runx2、OCN、Osx的mRNA和蛋白表达都增加，以及钙质沉积增加。（3）CFZ可呈剂量依赖性抑制Hes1的mRNA，cleavednotch1和Hes1的蛋白表达，并可呈剂量依赖性促进MM-MSCs成骨标志物Runx2、OCN、Osx的mRNA和蛋白表达量，并可促进钙质沉积增加。结论：MM-MSCs的成骨分化潜能大大降低，同时伴有notch1的失活障碍。CFZ可以抑制notch1的活性，促进MM-MSCs的成骨分化潜能。
【作者】李亚丽；
【导师】李炳宗；
【作者基本信息】苏州大学，内科学，2014，硕士
【关键词】多发性骨髓瘤；姜黄素；硼替佐米；化疗增敏；Notch1；间充质干细胞；notch1；成骨分化；Carfilzomib；

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