Rspo1基因转染间充质干细胞修复小鼠肠上皮辐射损伤

【摘要】随着核工业的发展，核科学技术的广泛应用以及核恐怖袭击的威胁，如何救治急性辐射损伤成为了当今迫切的需求。肠道对电离辐射十分敏感，肠上皮结构和功能受损是急性辐射性病难以救治的关键因素之一。肠隐窝干细胞及其干细胞龛遭受严重破坏，是肠隐窝-绒毛更新障碍的根本原因，是肠上皮结构和功能放射性损伤的关键病理机制。因此，亟待根据急性放射性病病程中肠上皮结构和功能损伤的病理机理特点，提出新型有效的针对性救治策略。间充质干细胞（Mesenchymalstemcells,MSCs）是一群来源于中胚层，异质性很强的具有自我更新能力的多能干细胞，能分化为脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞，肝细胞，神经元细胞，肌细胞，上皮细胞等细胞。此后大量研究表明，间充质干细胞可趋化至受伤发炎的部位，具备潜在的免疫调节能力，抗炎能力和营养作用，是组织工程，再生医学和自身免疫性疾病治疗的理想工具。新近发现的一种可溶性分子Rspo1（R-spondin1）可通过结合肠隐窝干细胞表面Lgr5和Lgr4的受体、竞争抑制Wnt通路拮抗剂DKK1等机制，调节并增强活化Wnt/β-catenin信号，促进肠隐窝干细胞增殖和分化。另外，人Rspo1可作用于小鼠肠隐窝干细胞，产生促增殖、分化和生存作用。鉴此，本文建立了肠上皮辐射损伤小鼠模型并观察了其损伤规律，通过基因转染的方法构建了一株稳定表达人Rspo1分子的间充质干细胞株并鉴定了其生物学活性，利用Rspo1基因转染的间充质干细胞株过继输注肠上皮辐射损伤小鼠，通过间充质干细胞发挥的免疫调节作用与Rspo1/β-catenin途径刺激肠隐窝干细胞增殖和分化的作用相联合，修复肠隐窝-绒毛更新机制，以期为急性放射病的有效救治提供新思路。一、肠上皮辐射损伤小鼠模型的建立及病理损伤规律
【作者】陆婷；
【导师】居颂光；
【作者基本信息】苏州大学，免疫学，2014，硕士
【目的】建立肠上皮辐射损伤小鼠模型，观察损伤病理变化规律。
【方法】分别以10Gy、12Gy、14Gy、16Gy和18Gy剂量单纯照射小鼠腹部，确定单纯腹部照射的最小致辐射死剂量。进而采用18Gy剂量照射Lgr5-EGFP-ires-CreERT2转基因小鼠，每日观察小鼠体重，并在辐照后0.5d、3.5d和6d取小鼠小肠，观察小肠的病理学改变规律，如小肠绒毛长度、肠隐窝数目以及肠隐窝Lgr5+干细胞的数量变化。
【结果】18Gy为单纯腹部照射建立肠上皮辐射损伤小鼠模型的最小致死剂量；与未处理组相比，腹部照射后小鼠体重逐步减轻、小肠绒毛变短、隐窝数目减少、肠隐窝干细胞数量在短时间内迅速减少。
【结论】本部分研究采用18Gy剂量单纯辐照小鼠腹部，建立了肠上皮辐射损伤小鼠模型。在此基础上观察了肠上皮辐射损伤病理规律。这为急性辐射损伤救治的研究提供了良好的研究工具。二、Rspo1基因转染间充质干细胞株的构建及生物学活性鉴定
【目的】构建稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株。
【方法】将人Rspo1全长cDNA重组入逆转录病毒载体pEGZ-Term，通过与辅助病毒载体共转染293T细胞，包装为具有感染力的完整重组病毒载体，收集培养上清感染间充质干细胞C3H10T1/2细胞株，筛选获得G418抗性的基因转染细胞，通过RT-PCR与流式细胞术检测感染后C3H10T1/2细胞Rspo1分子的表达，并采用细胞计数法观察其上清对结肠癌细胞株SW480增殖能力的促进作用。
【结果】成功构建pEGZ-Term/Rspo1逆转录病毒表达载体，获得了稳定表达人Rspo1的基因转染细胞株C3H10/Rspo1，该细胞株上清能促进SW480结肠癌细胞增殖。
【结论】建立了稳定表达Rspo1的基因转染间充质干细胞株，并证实其分泌的Rspo1具有生物学活性，为进一步利用Rspo1和间充质干细胞联合靶向作用于肠道干细胞救治肠上皮损伤的研究奠定了基础。三、Rspo1基因转染间充质干细胞修复小鼠肠上皮辐射损伤
【目的】利用间充质干细胞的保护作用联合Rspo1靶向修复肠上皮辐射损伤小鼠。
【方法】采用流式细胞术检测C3H10T1/2细胞株表面趋化因子受体和相关负性免疫分子的表达；通过胞内染色的方法，利用流式细胞术检测C3H10T1/2细胞株内相关免疫抑制与激活细胞因子的表达；利用ELISA法检测C3H10T1/2细胞上清中PEG2的含量；采用18Gy辐照剂量单纯照射小鼠腹部，将PBS、C3H10T1/2细胞株、第二部分构建的C3H10/mock细胞株及C3H10/Rspo1细胞株分别移植入肠上皮辐照损伤小鼠，每日观察小鼠的生存状况及体重变化。
【结果】C3H10T1/2细胞株可表达趋化因子受体CXCR4和PD-L1、B7H3、B7H4等多种负性免疫分子，产生TGF-β、IL-10、IL-4和分泌PGE2等免疫抑制因子；对于肠上皮辐照损伤小鼠，C3H10/Rspo1移植组小鼠的存活率大于单纯C3H10T1/2移植组小鼠的存活率，而PBS移植组小鼠在两周内全部死亡，同时C3H10/Rspo1移植组小鼠体重降低明显低于单纯C3H10T1/2移植组。
【结论】C3H10/Rspo1细胞株可通过表达的趋化因子受体定向的趋化至辐照损伤的肠上皮部位，通过发挥免疫抑制作用保护受损肠道干细胞，并分泌Rspo1分子，修复受辐照损伤的肠上皮。
【关键词】Rspo1；间充质干细胞；基因转染；辐射损伤；肠道干细胞；

【参考文献】
[1]谭玉阳,何川,张洪亮.基于初至旅行时差的微地震速度模型反演[J].石油地球物理勘探,2015,01:54-60+15.
[2]乔雪.宁夏亿嘉阳光国际贸易有限公司实施会员制营销的对策研究[D].宁夏大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[3]李锦超.节能电梯系统中双向DC-DC变换器关键技术的研究[D].哈尔滨工业大学,电机工程,2013,硕士.
[4]祝乔,胡广大.针对准单边Lipschitz不确定非线性时滞系统的稳定性分析(英文)[J].自动化学报,2009,07:1006-1009.
[5]田甜.抗战时期中共在职干部教育与马克思主义中国化[D].天津商业大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[6]侯云生.非法集资犯罪治理对策探析[D].华东政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[7]陆书亮.房地产项目风险分析及防范[D].吉林大学,项目管理,2013,硕士.
[8]闫爱萍.王沈《魏书》研究[D].山西大学,中国古代史,2004,硕士.
[9]曾国里.风咳停方联合阿斯美胶囊治疗感染后咳嗽临床观察[D].湖北中医药大学,中医内科学（专业学位）,2013,硕士.
[10]王红箫.中国社会转型期二人转的变异与传承[D].东北师范大学,文艺学,2014,博士.
[11]王青荣.微机高频开关电源的研制[D].华北电力大学（河北）,电气工程,2004,硕士.
[12]王培霞.中国共产党探索党内民主建设的历史经验研究[D].南京师范大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[13]胡继磊.基于Web服务封装的异构数据库集成与同步设计[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2012,硕士.
[14]郭雯.电影“撞”新闻[D].安徽大学,新闻学,2013,硕士.
[15]陈军能.WORM型含芴功能高分子信息存储材料的设计和制备[D].华东理工大学,2013.
[16]吴世琦.民事再审制度的功能缺陷及完善[D].安徽大学,法律,2003,硕士.
[17]毕佳丽.在线学习系统的分类体系及其特征研究[D].曲阜师范大学,教育技术学,2013,硕士.
[18]李国华.农民工随迁子女教育需要与社会支持研究[D].南京大学,社会工作,2013,硕士.
[19]孙豫.商丘市质监系统固定资产信息化管理改善研究[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[20]杨彬.益肾助阳活血化浊法治疗多囊卵巢综合征的临床疗效观察[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[21]陈立发.皮下盲袢式胆管空肠Roux-en-Y吻合术治疗复杂肝胆管结石病的临床分析[D].吉林大学,外科学,2013,硕士.
[22]余跃.基于竞争力提升的公立高校治理结构创新研究[D].南京航空航天大学,行政管理,2013,硕士.
[23]罗永生.嫩江县大豆产业发展现状及对策研究[D].中国农业科学院,农村与区域发展（专业学位）,2012,硕士.
[24]张凤娟,王乐.美国大学董事会构成与权责——基于四所大学的分析[J].中国成人教育,2014,01:106-109.
[25]靳志鑫.媒体视野中的民国山西武术[D].中北大学,民族传统体育学,2014,硕士.
[26]李轶楠,武涌,侯静,徐可西.新建居住建筑能效提升支撑体系[J].建筑科学,2015,04:21-25+44.
[27]谢丽荣,杨争林,张淳,环加飞.发输电一体化检修计划安全评估与辅助决策方法[J].电力系统自动化,2012,15:116-119.
[28]魏炜.安全型继电器电气特性自动测试系统设计与实现[D].西安工程大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[29]张圃.数字化颌面骨整形重建外科的初步研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2004.
[30]陈增强,车海平,袁著祉.具有比例积分结构的广义预测自校正控制器[J].控制与决策,1994,02:105-110.
[31]张景祥a,b,王士同b,蒋亦樟b,倪彤光b.基于ISE的核密度估计和随机置换的单一或协同特征的选择方法[J].控制与决策.
[32]崔杰,党耀国.一类新的弱化缓冲算子的构造及其应用[J].控制与决策,2008,07:741-744+750.
[33]荀冰畅.语文学科造句训练研究[D].西南大学,课程与教学论,2014,硕士.
[34]颜冰钧.BLDC无传感器控制方式下转子位置精确检测技术研究[D].华侨大学,电工理论与新技术,2014,硕士.
[35]孙丽娇.图的非正常L（p，q）-标号和非正常L（p，1）-全标号的研究[D].山东师范大学,应用数学,2013,硕士.
[36]刘芳.四川北部地区汉族人群AGT、XRCC1基因多态性与食管鳞癌风险的研究[D].川北医学院,肿瘤学,2014,硕士.
[37]谭晗凌.一种基于比较器的开关电容Sigma-Delta调制器的设计[D].华南理工大学,微电子学与固体电子学,2014,硕士.
[38]吴颖颖.中国法律词汇的语义演进[D].西南政法大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[39]张亮.石墨烯/氧化石墨烯结构及电子特性的同步辐射研究[D].中国科学技术大学,2013.
[40]桑苏玲.数据挖掘语言综述[J].固原师专学报,2005,03:42-44.
[41]火明才.升阳益胃汤对慢性萎缩性胃炎模型大鼠Bcl-2、Bax、MVD影响的实验研究[D].甘肃中医学院,中医临床基础,2014,硕士.
[42]解海艇.靶式流量计动态特性的标定方法[D].华侨大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[43]陈文艳.山区地形遥感图像水体信息的提取研究[D].广西师范大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[44]马骥.免疫性血小板减少症患者骨髓间质细胞及树突状细胞免疫功能异常的研究[D].山东大学,内科学,2014,博士.
[45]胡丽和.中国酒店命名的认知研究[D].湖南师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[46]黄昆.山杏仁多肽的制备及其对胆酸盐络合能力的研究[D].北京林业大学,农产品加工及贮藏,2013,硕士.
[47]朱琦.高梯度定向凝固Cu-Cr自生复合材料的组织与性能[D].西北工业大学,材料加工工程,2003,硕士.
[48]边丽匣.含氮杂环化合物的电化学氧化与降解过程中废水的毒性变化[D].浙江工商大学,环境工程（专业学位）,2014,硕士.
[49]任倩.“五四”女作家的自我书写与建构[D].河北师范大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[50]张静.凉山彝语“水田话”调查研究[D].中央民族大学,中国少数民族语言文学,2004,硕士.