孤核受体NR4A家族的表达与内质网应激的关系及其在胰岛β细胞中调控胰岛素基因表达的机制研究

【摘要】在真核细胞中内质网(ER)是钙离子储存、蛋白质合成、折叠、加工及质量监控的重要场所,当细胞质内钙离子浓度发生异常变化或者内质网难以承担蛋白折叠的高负荷时则引发内质网应激(ERstress),激活细胞的未折叠蛋白反应(UPR),细胞通过内质网跨膜蛋白ATF6、PERK和IRE1介导的三条关键的UPR信号通路,调控下游相关基因的表达,以增强内质网膜对钙离子转运及对蛋白折叠的处理能力,因此UPR通路在细胞的稳态平衡中具有举足轻重的作用。而这一动态过程的调控对于维持机体的正常生理功能至关重要,在肝脏、脂肪、胰岛以及下丘脑等不同的组织器官中,内质网应激均影响代谢活动。众所周知,随着人们生活水平的提高,糖尿病(尤其是2型糖尿病)的发病率呈快速升高的趋势。2型糖尿病病理发展的最终结果是胰岛β细胞的凋亡,目前人们普遍接受的机制是持续高糖、游离脂肪酸(FFA)可导致胰岛β细胞发生内质网应激,ERstress如不能被有效缓解或消除则可启动β细胞的凋亡程序。核受体是一类依赖配体激活的转录因子超家族,它具有三个功能结构域：N末端的激活结构域(AF-1)、中间的DNA结合结构域(DBD)和C末端的配体结合结构域(LBD)。根据核受体DBD序列的同源性发现了大量的孤核受体,它们的生理性配体及其功能最初并不清楚。NR4A家族即是这类孤核受体,目前尚未找到其天然的配体。NR4A1(又称为NUR77、TR3、NGFI-B)、NR4A2(又称为NURR1、RNR-1、TONOR)、NR4A3(又称为NOR1、MINOR)三者组成孤核受体NR4A家族。NR4A家族的三个成员在DBD区约91-95%的序列高度同源,LBD区约60%序列保守,而激活结构域序列变化较大。NR4A家族是一类早期即刻反应基因,细胞在感受到环境的生理与物理刺激时,这个家族的基因就会迅速反应,产生相应的蛋白,作为转录因子来调节一定的基因表达从而来应对这些刺激。目前关于NR4A家族与内质网应激的关系研究很少,而且NR4A家族分子与容易发生内质网应激的胰岛p细胞,特别是p细胞中胰岛素的分泌及表达的关系也有待去探索。本课题的工作分以下两部分展开：第一部分在胰岛p细胞和肝细胞中孤核受体NR4A家族的表达与内质网应激的关系研究目的：探讨在胰岛p细胞和肝细胞中,细胞发生内质网应激时孤核受体NR4A家族分子的动态表达变化及二者之间的关系。研究内容1、用不同浓度的内质网应激诱导剂TG(毒胡萝卜素)、TM(衣霉素)、PA(棕榈酸钠盐)、DTT(二硫苏糖醇)刺激小鼠胰岛p细胞MIN6,荧光定量PCR分析UPR标志分子Bip、Chop及NR4A家族三个成员(Nr4al、Nr4a2、Nr4a3)mRNA表达变化；逆转录PCR(RT-PCR)分析UPR标志分子剪接型Xbpl(sXbp1)的表达变化,筛选出既能激活细胞UPR又能诱导NR4A家族表达的合适加药剂量。2、对培养的小鼠胰岛p细胞MIN6、人肝癌细胞HepG2、小鼠肝癌细胞Hepal-6、小鼠脂肪前体细胞3T3-L1完全置换新鲜培养基,荧光定量PCR分析换液后0h,1h,2h,3h,4h,6h,9h,12hNR4A家族分子mRNA表达变化,westernblotting分析NR4A1蛋白表达变化,为后续加药方式提供实验依据。3、用0.5μMTG分别处理小鼠胰岛p细胞MIN6、人肝癌细胞HepG2和小鼠肝癌细胞Hepal-6,在加药后Oh、15min、30min、1h、2h、3h、6h、9h、12h分别收集细胞提取RNA和蛋白质,用RT-PCR、荧光定量PCR和westernblotting技术分析细胞发生内质网应激及NR4A家族分子的动态表达变化。4、用10μg/mlTM分别处理小鼠胰岛β细胞MIN6、人肝癌细胞HepG2和小鼠肝癌细胞Hepal-6,在加药后0h、15min、30min、1h、2h、3h、6h、9h、12h分别收集细胞提取RNA和蛋白质,用RT-PCR、荧光定量PCR和westernblotting技术分析细胞发生内质网应激及NR4A家族分子的动态表达变化。5、用0.5mMPA分别处理小鼠胰岛p细胞MIN6、人肝癌细胞HepG2和小鼠肝癌细胞Hepa1-6,在加药后6h.8h、10h、12h、16h、20h、24h分别收集细胞提取RNA和蛋白质,用RT-PCR、荧光定量PCR和westernblotting技术分析细胞发生内质网应激及NR4A家族分子的动态表达变化。6、用3mMDTT分别处理小鼠胰岛β细胞MIN6、人肝癌细胞HepG2和小鼠肝癌细胞Hepa1-6,在加药后Oh、30min、1h、2h、3h、4h、6h、9h分别收集细胞提取RNA,用RT-PCR和荧光定量PCR技术分析细胞发生内质网应激及NR4A家族分子的动态表达变化。7、选用C57BL/6-ob/ob雌性小鼠为实验材料,同周龄的C57BL/6小鼠为对照组,以基础饲料喂养,每周称量动物体重一次,建立小鼠肥胖症动物模型。造模成功后,处死动物,取胰腺、肝脏组织进行RNA提取,荧光定量PCR分析肥胖体征动物中UPR标志分子及NR4A家族分子的表达变化。8、用0.5μMTG刺激MIN6细胞Oh、3h、6h,通过细胞核质分离试剂盒抽提核蛋白和胞浆蛋白,以westernblotting技术分析NR4A1在细胞中的表达及分布情况。9、用0.5μMTG刺激HepG2细胞2h,0.5mMPA刺激HepG2细胞10h,对细胞进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察细胞内NR4A1的表达及分布情况。研究结果1、MIN6细胞中,0.1-1μMTG处理2h、10μg/mlTM处理3h、2-4mMDTT刺激2h、0.4-0.8mMPA刺激12h能极显著的诱导细胞发生内质网应激,激活未折叠蛋白反应(UPR)(P<0.01),导致NR4A家族分子mRNA表达显著增加(P<0.01),为后续实验筛选出各诱导剂的合适剂量,即0.5μMTG、10μg/mlTM、3mMDTT、0.5mMPA。2、MIN6、HepG2、Hepa1-6、3T3-L1四种细胞在完全置换培养基后4h内,NR4A家族三个分子1mRNA水平均明显升高；MIN6细胞中NR4A1蛋白水平在换液后1-6h显著高于基础水平,2h达到峰值；换液6h后NR4A家族三个分子mRNA和蛋白水平逐渐下降恢复到基础水平,这说明换液短时间内NR4A家族处于高表达水平,因此需要改变后续实验中的加药方式,即在加药处理前12h给细胞换新鲜培养基,加药时吸取一定体积的诱导剂贮存液(1mMTG、5mg/mlTM、1MDTT)直接加入培养基中；而0.5mMPA仍采取完全置换含药培养基的处理方式。3、用0.5μMTG处理小鼠胰岛β细胞MIN6、人肝癌细胞HepG2和小鼠肝癌细胞Hepa1-6三种细胞,均能诱导细胞发生典型的内质网应激,激活细胞未折叠蛋白反应(UPR),同时诱导孤核受体NR4A家族所有分子的表达,其中以NR4A1和NR4A2表达升高程度更为显著。4、用10μg/mlTM处理MIN6、HepG2、Hepal-6三种细胞,同TG处理一样,均能诱导细胞发生典型的内质网应激,激活细胞未折叠蛋白反应(UPR),NR4A分子被诱导表达,但NR4A家族mRNA在TM处理后的表达增加幅度远远低于TG处理,最高增加倍数仅为TG处理增加倍数的40%,且TM处理时以NR4A2分子应答为主。5、用0.5mMPA处理MIN6、HepG2、Hepal-6三种细胞,虽然能激活UPR相关信号通路的分子表达,但各基因表达增加幅度远远低于TG处理；同时PA诱导表达的NR4A家族mRNA增加幅度也相应的低于TG处理。在不同的细胞中对PA处理发生应答的NR4A成员也不同。6、用3mMDTT处理MIN6细胞、HepG2细胞引起内质网应激和NR4A家族诱导表达升高的方式和程度同0.5μMTG处理这两种细胞相似。但3mMDTT对小鼠Hepal-6细胞的刺激结果同10μg/mlTM、0.5mMPA处理Hepal-6细胞类似。7、10周龄ob/ob小鼠体重是对照小鼠体重的1.7倍,ob/ob小鼠呈明显的肥胖症体征,荧光定量PCR分析表明肥胖小鼠胰腺和肝脏中UPR分子Bip、Chop表达明显升高,孤核受体NR4A家族成员的mRNA水平也显著高于对照小鼠。8、用0.5μMTG处理MIN6细胞3h、6h,用westernblotting法分析细胞核蛋白和胞浆蛋白中NR4A1的表达,发现TG处理诱导表达升高的NR4A1蛋白主要集中分布于细胞核中；用0.5μMTG处理HepG2细胞2h、0.5mMPA处理HepG2细胞10h,对细胞进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察结果表示TG或PA诱导表达升高的NR4A1蛋白主要集中分布于细胞核内。研究结论本部分实验可得出以下结论：1、由于NR4A家族是早期即刻反应基因,完全置换培养基就能诱导其表达,因此时间动态实验中应注意加药方式,即细胞换液12h后,吸取一定体积的TG、TM、DTT诱导剂贮存液直接加入培养基中；而PA需要长时间刺激才能诱导细胞发生内质网应激,因此仍采取完全置换含药培养基的方式加药处理。2、用0.5μMTG、10μg/mlTM、0.5mMPA、3mMDTT,四种ERstress诱导剂处理胰岛β细胞和肝细胞,在一定时间内均能激活细胞的未折叠蛋白反应,同时细胞中孤核受体NR4A家族表达升高,虽然不同试剂的处理引起NR4A家族表达升高的幅度不同,但均说明细胞发生内质网应激时也引起NR4A家族的表达升高。3、在肥胖动物特别是基因缺陷造成的ob/ob肥胖症小鼠中,肝脏、胰腺等组织中有明显的内质网应激发生,同时NR4A家族分子的表达水平与内质网应激呈一定的正相关。4、在细胞发生内质网应激时,表达升高的NR4A分子集中分布于细胞核中,这可能与NR4A分子作为转录因子调控基因表达有关。第二部分孤核受体NR4A家族对胰岛p细胞中胰岛素基因表达的调控研究目的：探讨孤核受体NR4A家族在胰岛β细胞中对胰岛素基因表达的影响及调控机制。研究内容1、通过AdEasy系统构建包装纯化过表达NR4A1、NR4A3分子的两种重组腺病毒(Ad-NR4A1-HA、Ad-NR4A3),选择只表达GFP的载体腺病毒为对照病毒(Ad-GFP),通过紫外分光光度法和梯度稀释感染法检测病毒效价。2、用0.5μMTG、0.5mMPA刺激小鼠胰岛p细胞MIN6,以及用重组腺病毒感染MIN6细胞后,通过碘([125]I)放射免疫法测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。3、把Ad-NR4A1-HA,Ad-NR4A3两种重组腺病毒分别梯度稀释,用对照病毒Ad-GFP按相当效价剂量补充以保证每组病毒颗粒数一致,感染两种胰岛p细胞(MIN6、INS1),44h后通过放射免疫法测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平；用同样方法稀释的腺病毒Ad-NR4A3感染MIN6细胞48h后,收集细胞提取RNA,RT-PCR分析腺病毒感染后胰岛素基因mRNA转录水平的变化。4、相当效价的三种腺病毒(0.5μl/mlAd-NR4A1-HA、0.5μl/mlAd-NR4A3、0.25μl/mlAd-GFP)感染接种于飞片上的MIN6细胞,通过细胞免疫荧光染色分析过表达NR4A1、NR4A3蛋白在MIN6细胞中的定位分布情况。5、用过表达NR4A1的慢病毒感染MIN6细胞,通过嘌呤霉素筛选稳定表达NR4A1的细胞株,收集细胞进行细胞核蛋白和胞浆蛋白分离抽提,westernblotting检测NR4A1在MIN6细胞中的定位分布情况。6、通过基因工程的方法构建hNR4A3cDNA野生型及各结构域缺失突变体过表达重组质粒(全长野生型、ΔAF112-288aa,ΔDBD292-364aa,ΔLBD398-626aa),lipofectamine2000转染各种质粒进入MIN6细胞中,通过稻瘟菌素筛选稳定表达各种突变体的MIN6细胞株,westernblotting检测各蛋白过表达水平,RT-PCR分析各种稳转细胞株中胰岛素基因Ins1、Ins2的转录表达水平。7、相当效价的三种腺病毒(0.5μl/mlAd-NR4A1-HA、0.5μl/mlAd-NR4A3、0.25μl/mlAd-GFP)感染两种胰岛p细胞(MIN6、INS1),RT-PCR和荧光定量PCR分析胰岛素基因及调控胰岛素表达的转录因子(NeuroDl、Pdxl、MafA、Glis3)mRNA转录表达情况。研究结果：1、成功构建包装纯化了三种腺病毒,效价相当的三种病毒的使用剂量为0.5μl/mlAd-NR4A1-HA、0.5μl/mlAd-NR4A3.0.25μl/mlAd-GFP,感染MIN6细胞后均能达到80%以上的感染率。2、用0.5μMTG、0.5mMPA处理MIN6细胞显著降低了细胞分泌胰岛素的能力；用Ad-NR4A1-HA、Ad-NR4A3腺病毒感染MIN6细胞也显著减少了细胞分泌到上清中的胰岛素含量(p<0.01),初步说明NR4A1/3过表达抑制了MIN6细胞的胰岛素分泌功能。3、梯度稀释后的腺病毒感染两种胰岛p细胞,GSIS结果表明随着NR4A1/3蛋白的表达增加,细胞分泌的胰岛素下降,即NR4A1/3的表达量与细胞分泌的胰岛素呈负相关；RT-PCR结果同样说明胰岛素基因mRNA表达水平与NR4A3蛋白水平呈负相关,即NR4A3蛋白表达越多,Insl和Ins2基因转录表达越少,说明孤核受体NR4A家族分子具有下调胰岛p细胞中胰岛素基因表达的功能。4、不管在重组NR4A1/3腺病毒感染的MIN6细胞中,还是筛选出的稳定过表达NR4A1的MIN6细胞株中,过表达的NR4A分子均集中分布在细胞核中。5、筛选得到NR4A3野生型和各结构域缺失突变体的稳定过表达MIN6细胞株；野生型(N)和LBD缺失突变型(AL)细胞株中胰岛素基因(Ins1、Ins2)的转录明显低于对照细胞；而AF1区缺失型(AA)和DBD区缺失型(△D)细胞株中胰岛素基因mRNA转录表达与对照细胞无明显的区别,说明NR4A3分子中的AF1区和DBD区对下调胰岛素基因转录是必需的。6、两种重组腺病毒(Ad-NR4A1-HA、Ad-NR4A3)感染两种胰岛p细胞(MIN6、INS1),荧光定量PCR分析说明NR4A腺病毒感染的细胞中胰岛素基因、胰岛素调控因子基因mRNA水平均显著低于对照病毒感染的细胞,说明NR4A家族可以通过抑制胰岛素相关调控因子的转录间接的下调胰岛素基因的表达。研究结论：1、成功构建了过表达NR4A家族分子的重组腺病毒及各种稳转MIN6细胞株。2、在MIN6细胞中过表达的NR4A家族蛋白集中分布在细胞核中,起转录调控因子的作用。3、在胰岛β细胞中,NR4A家族通过抑制胰岛素转录因子的表达间接下调胰岛素基因的转录,抑制胰岛素蛋白的分泌,从某种程度上可能缓解了胰岛p细胞中内质网应激的压力,起到保护细胞的作用。
【作者】高伟娜；
【导师】王向东；
【作者基本信息】山东大学，细胞生物学，2014，博士
【关键词】内质网应激；未折叠蛋白反应；TG；TM；DTT；PA；NR4A家族；ob/ob小鼠；腺病毒；胰岛素基因表达；突变体；转录因子；胰岛素分泌；核定位；

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