肾上腺髓质素抑制剂ADM_(22-52)对高糖诱导人视网膜毛细血管内皮细胞作用的研究

【摘要】背景与目的糖尿病性视网膜病变(Diabeticretinopathy,DR)是糖尿病患者最常见和最严重的微血管并发症之一，最终会导致患者视力的下降乃至失明。早期的临床表现主要为：眼底微血管瘤和出血点，进而血管扭曲、扩张，视网膜血管狭窄导致视网膜缺血，最终形成新生血管。增殖型糖尿病性视网膜病变(Proliferativediabeticretinopathy,PDR)的一个重要标志是眼底新生血管的形成，近年来，随着DR患病率的不断升高，DR已成为50岁以上患者致盲的主要原因。肾上腺髓质素(Adrenomedullin,ADM)是一种具有多种生物活性的多肽，广泛参与机体活动。有研究表明，其在新生血管的形成过程中发挥了重要的作用。但是，目前对肾上腺髓质素的研究还主要集中在肿瘤方面，对眼部新生血管作用的研究甚少。本研究旨在探讨肾上腺髓质素抑制剂(Adrenomedullin22-52,ADM22-52)对高糖诱导的人视网膜毛细血管内皮细胞的作用及其机制。在体外实验中，分别运用CCK-8实验、划痕实验和管腔形成实验来探讨ADM22-52对高糖状态下人视网膜毛细血管内皮细胞增殖迁移和血管网形成的影响并探讨其可能的作用机制。明确ADM22-52对高糖状态下人视网膜毛细血管内皮细胞的影响，可能会为临床治疗糖尿病性视网膜病变（视网膜新生血管）提供一定的依据。材料和方法1.将HRECs分成三组，加入不同浓度的糖溶液（5mM,15mM,30mM）干预24h后抽提细胞RNA，检测不同糖浓度对ADM表达的影响。2.将细胞分成4组（5mM,30mM,30mM+100ng/mlADM22-52,30mM+1000ng/mlADM22-52），均匀加入到6孔板内，待细胞铺满板底后，无菌黄枪尖垂直板底进行划痕，去除漂浮的细胞后，加入含不同浓度糖和ADM22-52的无血清培养基，于含5%CO2的37℃培养箱中培养，并于0h、12h、24h拍照，PhotoshopCS2软件计算迁移距离。3.将细胞分成5组（5mM,30mM,30mM+10ng/mlADM22-52,30mM+100ng/mlADM22-52,30mM+1000ng/mlADM22-52），将细胞加入96孔板内，每孔约4000细胞，待细胞贴壁，饥饿处理24h后，加入不同糖及ADM22-52药物浓度干预24h后，每孔加入CCK-810μl，37℃培养箱放置2到4h，酶联仪检测每孔内450nm波长的吸光度(OD值)，记录并分析。4.将1.5×104细胞以及糖和药物ADM22-52加入到含Matrigel基质胶的96孔板内，培养箱内培养8h后拍照，管腔数目统计并分析。5.在糖和药物ADM22-52处理细胞8h后，抽提RNA，运用RT-PCR技术检测VEGF、TSP-1、ADAMTS-1的表达。6.在糖和药物ADM22-52处理细胞24h后，抽取细胞蛋白，运用Westernblot技术检测VEGF、PI3K蛋白的表达。结果1.RT-PCR结果显示，与5mM糖浓度相比，30mM的糖浓度能够促进细胞ADM和VEGF的表达(P<0.05)。2.与正常糖浓度相比，高糖能明显促进细胞的迁移和管腔形成，同时这种作用能够被ADM22-52所阻断(P<0.05)。3.CCK-8实验显示1000ng/ml的ADM22-52能够抑制细胞的增殖，差异具有统计学意义(P<0.05)。而糖浓度的变化对细胞的增殖无明显差异(P>0.05)。4.RT-PCR结果显示，5μg/ml的ADM22-52能够抑制高糖诱导的VEGF基因的表达，促进ADAMTS-1的表达(P<0.05)。5.Westernblot结果显示，5μg/mlADM22-52能够抑制VEGF、PI3K蛋白的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.高糖能够促进HRECs的迁移以及管腔形成；促进其ADM，VEGF基因的表达；2.ADM22-52对HRECs的迁移、增殖及管腔形成具有抑制作用；3.ADM22-52能够抑制HRECsVEGF、PI3K分子的表达，促进ADAMTS-1的表达。
【作者】陈志刚；
【导师】陆培荣；
【作者基本信息】苏州大学，眼科学，2014，硕士
【关键词】人视网膜毛细血管内皮细胞；肾上腺髓质素；新生血管；

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