急性髓系白血病患者NPM1突变体特异性T细胞免疫应答的研究

【摘要】本论文包括两部分内容：(一)体外诱导突变型NPM1抗原肽特异性T淋巴细胞的研究；(二)急性髓系白血病患者突变型NPM1抗原肽特异性T淋巴细胞的检测。
【作者】程珍；
【导师】孙爱宁；陈广华；
【作者基本信息】苏州大学，血液病学，2014，硕士
【目的】采用负载突变型NPM1(NPM1mut)抗原肽的树突状细胞(DCs)体外刺激健康供者自身的淋巴细胞，以诱导针对此肽的特异性T细胞免疫应答；并且检测伴随NPM1mut急性髓系白血病(NPM1mut+AML)患者的外周血中是否存在NPM1mut抗原肽特异性T淋巴细胞。以期为白血病患者的免疫治疗提供理论依据。
【方法】1.NPM1基因突变检测：本院初诊AML患者常规行基因突变组套检测。基本方法是从患者骨髓或外周血的单个核细胞中提取基因组DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增NPM1基因的12号外显子，直接测序PCR产物。2.人类白细胞抗原(HLA)基因分型：采用聚合酶链式反应-直接测序分型法(PCR-SBT)检测HLA-A、B、C、DRB1、DQB1五个基因座位。3.样本的采集及保存：采集HLA-A*0201或A*1101阳性健康供者以及NPM1mut+AML患者缓解期的外周血。Ficoll密度梯度法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，-80℃冰箱冻存24小时后，放入液态中冻存。4.CD8+T细胞表位预测及表位肽合成：通过Net-CTL1.2、Rankpep及SYFPEITHI三种程序软件预测NPM1野生型(NPM1wild)及NPM1mut-A/D的氨基酸序列与HLA-A*0201、A*1101或A*2402分子结合的抗原肽。采用固相合成法合成得分最高的表位肽，纯度均>95%。5.DCs的培养：取密度为3~5×106/ml新鲜或解冻复苏的健康供者PBMCs3ml接种于六孔板，采用贴壁法在37℃含5%CO2细胞培养箱中静置培养2h。吸掉上层培养基及未贴壁细胞，贴壁的单核细胞以含有GM-CSF、IL-4的无血清培养基进行培养，诱导单核细胞向未成熟DCs分化。培养5天后换用含有GM-CSF、IL-4、IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2的无血清培养基继续培养2天，诱导DCs成熟。第7天收集DCs，作为抗原递呈细胞(APC)以及进行表型鉴定。6.细胞毒性T细胞的活化与增殖：DCs分别负载NPM1野生型及突变型抗原肽后(同时设空载组)，用γ射线(40Gy)照射处理。然后与解冻复苏的自身PBMCs按照细胞数1:10的比例加入24孔板中混合培养。培养基为含有IL-2及IL-7的无血清培养基。于培养的第7天按上述方法进行重复刺激。7.ELISPOT分析及流式胞内染色检测：混合淋巴细胞肽培养（MPLCs）的第7、14天采用酶联免疫斑点(ELISPOT)以及胞内染色的方法检测三组淋巴细胞IFN-γ的分泌。以T2细胞株作为靶细胞，设空白对照组(未负载肽组)、负载野生型表位肽组、负载突变型表位肽组，比较三组的差异。对于HLA-A*1101阳性的供者，采用自身的DCs作为靶细胞。AML患者外周血标本经解冻复苏、过夜休息后进行ELISPOT分析。
【结果】1.我国汉族人群中，HLA-A位点中A*1101、A*2402以及A*0201三种等位基因是最为常见的。2.经过上述三种程序软件预测筛选，HLA-A*0201限制性NPM1wild九肽为DLWQWRKSL，NPM1mut-A/D九肽AIQDLCLAV。对于HLA-A*1101限制性的表位肽，野生型无合适的表位肽，突变型(A/D)九肽为AVEEVSLRK。未筛选到合适的HLA-A*2402限制性表位肽。3.DCs培养7天后检测其细胞表面抗原的表达量：CD142.6%。CD8043.4%、CD8337.8%、CD8699.9%、HLA-DR67.1%，符合DCs的表型。4.DCs与自身的PBMCs(健康供者)混合培养的第10天左右，淋巴细胞出现大量增殖，突变型肽组最为显著。第7天，所有样本的ELISPOT检测结果均为阴性，阳性质控孔均正常；第14天，有3例健康供者的ELISPOT突变肽型孔为阳性，而野生型肽孔为阴性；此时突变型肽孔中的NPM1mut抗原肽特异性的T淋巴细胞阳性率[=(突变型肽孔的平均斑点数-空白对照孔的平均斑点数)/每孔中加入的淋巴细胞]平均约为1/2000。胞内染色的流式结果显示（CD3+CD8+细胞群设门）：ELISPOT检测结果阳性的供者于第7、14天突变型肽组CD8+IFN-γ+细胞的阳性率高于空白对照组，而野生型肽组与空白对照组无没有明显差异。5.6例NPM1mut+AML患者的外周血ELISPOT检测结果显示，只有1例(16.7%)患者样本的检测结果可疑阳性。
【结论】健康人中，负载NPM1mut抗原肽的DCs可以刺激诱导自身的淋巴细胞，产生突变型NPM1抗原肽特异性T细胞免疫应答，有望用于AML患者的免疫治疗。在NPM1mut+AML患者外周血中，NPM1mut抗原肽特异性T细胞检出率低，提示AML患者受化疗及疾病本身的影响免疫功能低下缺少应答，或许可以考虑来自亲缘供体的细胞免疫治疗。本研究结果为AML患者的免疫治疗提供了的理论基础。
【关键词】白血病；髓样；NPM1基因突变；T细胞；酶链免疫斑点；胞内染色；

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