纯钛表面氨基等离子体活化对成骨细胞黏附的影响及其机制研究

【摘要】目的与背景：骨结合即种植体表面和受植骨之间的直接连接，没有纤维性结缔组织间隔。这一理论改写了口腔种植的历史，至今仍是口腔种植的基础理论，也是评价种植义齿成功与否的最重要的标准之一。为了达到这一金标准，种植体表面改性成为学者们关注的焦点。越来越多的研究指出，良好的骨结合需要一个可以稳定附着在纯钛种植体表面上的生物界面，而以往的表面改性方法又存在诸多问题（如涂层不稳定、表面改性效率低、改性效果不易操控等），学者们亟待寻找一种活化效率高、不存在界面应力、表面改性效果易于控制的改性方法。本课题组前期采用低温等离子体对纯钛表面进行改性，成功引入氨基功能团，研究并初步证实了改性后的表面稳定，明显提高了纯钛表面的生物相容性。表面改性所采用的低温气体放电等离子体（也称为等离子体增强的化学气相沉积，PECVD）主要用于工业领域的聚合物表面改性及医疗器械消毒，而在生物材料改性方面的应用近年来才引起学者们的关注。种植体/骨界面的新骨生长方式分为远端成骨和接触成骨两种，普遍认为接触成骨更能解释骨结合界面的理想状态[1,2]。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，其分泌类骨质（骨基质未矿化的有机成分）。随着类骨质的沉积、矿化，成骨细胞陷入骨陷窝，成为骨衬里层细胞或者发生凋亡[3]。接触成骨的发生过程是成骨细胞首先在种植体表面黏附、丛集、分泌骨基质，由此启动种植体表面新骨的直接生成，新骨从种植体表面逐渐向骨创面生长、延伸。成骨细胞作为锚合依赖性细胞其在种植体表面的黏附、丛集是接触成骨的关键[4]。细胞对于生物材料的黏附主要由整合素调节，普遍认为整合素α2亚单位与成骨细胞黏附关系密切。深入理解细胞在生物材料，尤其是生物活性材料表面的黏附性能是优化种植体/骨界面的关键。本研究旨在通过射频低温等离子体聚合，在纯钛种植体表面形成纳米级厚度的聚合物薄膜，引入氨基这一具有生物活性的功能团，研究其对成骨细胞黏附的影响与其作用机制。方法：采用射频低温等离子体方法，以庚胺为聚合单体，在纯钛种植体表面引入具有生物活性的氨基功能团，根据选定的相对最佳的等离子体放电实验参数，制备了五种不同放电模式等离子体活化表面的钛片：CW、P(10%)、P(30%)、P(60%)、CW+P(30%)，其中CW表示连续波功率输出模式，P表示脉冲功率输出模式，脉冲模式下又根据不同的占空比分为10%、30%及60%，CW+P为连续波偶联脉冲功率输出模式，未处理的纯钛表面作为对照组：Ti。实验通过CCK-8细胞毒性实验检测氨基等离子体活化表面对成骨细胞存活的影响；成骨细胞与材料共培养5min、30min、120min时，通过流式细胞仪绝对计数、DAPI染色观察不同改性参数对成骨细胞黏附的影响；采用免疫染色技术及蛋白免疫印迹法观察黏附相关蛋白整合素α2、局部粘着斑激酶（FAK）、磷酸化局部粘着斑激酶（p-FAK）表达的变化，初步探讨活化表面对成骨细胞黏附的影响及其机制。结果：1.CCK-8法检测等离子体活化表面的细胞毒性：各组活化表面无细胞毒性，不会抑制细胞的增殖。2.流式细胞仪绝对计数法检测成骨细胞黏附率：CW+P(30%)组在与成骨细胞共孵育的5min、30min和120min，成骨细胞黏附率均显著高于Ti组（p<0.01）及其他活化组，表现出良好的促进成骨细胞黏附的特性；P(30%)组在共孵育5min、120min的成骨细胞黏附率均高于Ti组（p<0.05）；CW组在30min、120min的成骨细胞黏附率均高于Ti组（p<0.05）。3.DAPI染色观察发现P(30%)、CW+P(30%)组材料表面成骨细胞数量明显多于Ti组，且细胞排列更紧密。CW、P(10%)、P(60%)组表面也较Ti组黏附了更多的成骨细胞。扫描电镜观察发现Ti组钛片表面成骨细胞多呈团缩状，黏附面积小，黏附不牢固，细胞明显翘起；CW、CW+P(30%)和P(30%)组活化表面成骨细胞黏附好，黏附面积大，无明显翘起；尤CW+P(30%)组，细胞充分伸展并伸出多个伪足，充分贴附于材料表面，伸展面积大，黏附牢固。4.免疫荧光染色情况：CW、CW+P(30%)和P(30%)组中两种蛋白α2和p-FAK的表达量均显著高于Ti组，尤CW+P(30%)组最突出；CW+P(30%)、P(30%)组的α2和p-FAK共同表达区明显，延伸至细胞突起区域，相对荧光光度值高。5.Westernblot检测黏附相关蛋白表达情况：共孵育12h后，CW、P(30%)、CW+P(30%)组钛片表面黏附细胞的α2和p-FAK蛋白表达量显著的高于Ti组（p<0.01），尤CW+P(30%)组最明显（p<0.001）。结论：1.氨基等离子体活化的纯钛表面具有良好的生物相容性，适合细胞在其上生长，该种纯钛表面处理方法可用于种植体表面处理而应用于体内；2.氨基等离子体活化的纯钛表面对MC3T3-E1早期黏附有显著促进作用；3.氨基等离子体活化的纯钛表面显著促进MC3T3-E1黏附相关蛋白α2的表达和FAK的活化，提示激活FAK信号通路以促进细胞黏附、增殖与分化；4.构建氨基等离子体活化后的纯钛表面，为促进种植体早期骨整合提供实验理论依据。
【作者】路萌萌；
【导师】周延民；
【作者基本信息】吉林大学，口腔医学，2014，硕士
【关键词】低温等离子体；骨结合；氨基基团；钛；成骨细胞；细胞黏附；

【参考文献】
[1]靳凌峰.辽宁省属高校教师薪酬激励机制研究[D].沈阳师范大学,高等教育学,2014,硕士.
[2]曲欣.A Corpus-based Study on Modality in Chinese Criminal Law and Its English Version[D].中国政法大学,英语语言文学,2013,硕士.
[3]杨梦霞.YM公司中层管理人员绩效考核体系改进研究[D].合肥工业大学,企业管理,2013,硕士.
[4]徐明辉.基于复合储能的混合动力电动汽车再生制动能量回馈研究[D].兰州理工大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[5]张江源.散乱数据的曲面重构技术研究[D].华侨大学,机械电子工程,2013,硕士.
[6]刘德宝.数据空间内基于内容的文本文件管理策略研究[D].东北大学,计算机应用技术,2010,硕士.
[7]毛仕宇.基于J2EE架构的政府安全应急预案智能平台的设计与实现[D].天津大学,软件工程,2013,硕士.
[8]曹俊.基于结构元理论的模糊多属性群决策[D].辽宁工程技术大学,应用数学,2012,硕士.
[9]陈云升.历史剧核心问题研究[D].中国戏曲学院,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[10]刘晓华.《八月之光》中光明与黑暗的象征意义[D].河北师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[11]邹和均,刘谦,张希智.244.5mm套管开窗侧钻技术在托参1井的应用[J].吐哈油气.2001(03)
[12]魏文潇.含电动汽车的配电网区间优化研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2014,硕士.
[13]夏江汉.融资租赁定价研究[D].浙江大学,金融学,2013,硕士.
[14]姚盼盼.基于改进灰色聚类的铁谱图像分割[D].南京航空航天大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[15]李广利.煤矿班组长胜任特征模型研究[D].西安科技大学,安全技术及工程,2013,硕士.
[16]种德雨.利民煤矿迎回采面沿空掘巷围岩稳定控制技术研究[D].中国矿业大学,采矿工程,2014,硕士.
[17]姜楠.当前社会形势下服务型警务制度构建研究[D].山东师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[18]董小征.《五音集韵》与《切韵指南》音系之比较研究[D].福建师范大学,汉语言文字学,2004,硕士.
[19]吴月德.成本型人力资源管理系统与组织绩效关系及其干预机制研究[D].华南理工大学,管理决策与系统理论,2012,硕士.
[20]曹李宁.TD-SCDMA系统分组调度技术研究[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2008,硕士.
[21]张青丽.科学发展观视角下的产业结构调整研究[D].西安科技大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[22]董毅.云南香格里拉阿热岩体年代学与地球化学[D].成都理工大学,矿物学、岩石学、矿床学,2013,硕士.
[23]叶萍.双转子连续混炼机离散熔融过程建模及可视化研究[D].华东理工大学,化工过程机械,2014,硕士.
[24]贾玉红.陕北地区降水频率分布参数计算方法研究[D].西北农林科技大学,水利工程,2012,硕士.
[25]周明畅.九一八事变后的报界舆论及其政治诉求[D].华中师范大学,中国近现代史,2014,硕士.
[26]董西洋.反硝化细菌对络合脱硝液中Fe（Ⅲ）EDTA和Fe（Ⅱ）EDTA-NO的还原[D].大连理工大学,环境工程,2013,硕士.
[27]刘娇丽.基于LDA模型的领域自动问答系统[D].安徽大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[28]周方.基于模板技术的网站内容管理系统的设计与实现[D].北京交通大学,2009.
[29]刘书,吴生富.小松式机械压力机芯轴的设计计算[J].一重技术.1997(03)
[30]丁雅丽,齐广山,田杰芳.我国建立工程担保制度的探讨[J].工程经济,2004,08:11-13.
[31]蔡健.控制排水条件下农田土壤氮素迁移转化试验研究[D].扬州大学,农业水土工程,2011,硕士.
[32]姬彩桥.iPP/PET纤维复合材料的结晶行为研究[D].郑州大学,材料加工工程,2013,硕士.
[33]邱月.中哈跨界河流水资源利用合作的法律问题研究[D].新疆大学,国际法学,2013,硕士.
[34]王沛然.1976年后的《诗刊》诗评研究[D].青岛大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[35]王乃鑫.动态自组装聚电解质及纳米杂化复合分离膜研究[D].北京工业大学,2013.
[36]张争争.Al-4.5%Cu合金DC铸造过程的宏观偏析[D].东北大学,材料加工工程,2011,硕士.
[37]郭庆鼎,迟林春,王成元.基于神经网络给定补偿的永磁同步直线交流伺服系统H~∞控制[J].控制与决策,2000,01:75-78.
[38]何雨雄.FL制衣有限公司战略转型研究[D].西北工业大学,2002.
[39]朱伟伟.基于标识分离的混合交换路由系统设计与实现[D].北京交通大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[40]纪晓蕾.疼痛的意义对疼痛的影响研究[D].西南大学,应用心理学,2013,硕士.
[41]李亭亭.垂直线源井地电磁法一维正演及勘探深度研究[D].吉林大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[42]马攀.危险废物焚烧系统的数值模拟与试验研究[D].浙江大学,2012.
[43]陈昕.集成材料在建筑室内中模块式设计应用研究[D].湖北工业大学,环境艺术设计,2013,硕士.
[44]林旭东,钱小琴,刘凌云,崔永忠.我国激光科研成果文献的统计与分析[J].激光杂志,2015,02:1-5.
[45]熊洁.华光集团薪酬解决方案[D].湖南大学,2003.
[46]李涛.民国时期国立大学数量及区域分布变迁[J].华东师范大学学报(教育科学版),2014,02:104-110.
[47]孙廷琮,吴秉勤,张格,王泓.提高刷式集流环主要性能指标的研究[J].农业机械学报.1992(01)
[48]刘瑞平.自然因素与社会经济因素对耕地质量的贡献率研究[D].中国农业大学,2004.
[49]李旸.中国服务贸易国际竞争力评价与对策分析[D].山西财经大学,国际贸易学,2014,硕士.
[50]张家娟.关于图的一些标号的研究[D].西北师范大学,运筹学与控制论,2013,硕士.