牙龈卟啉单胞菌脂多糖对成骨细胞EphA2表达调控的研究

【摘要】背景牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis，Pg）是牙周病重要的可疑致病菌，该菌可产生大量的毒力因子，如内毒素、胶原酶、胰酶样蛋白酶等，将引起牙周结缔组织的破坏和牙槽骨的吸收，其中内毒素也称脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是引发牙槽骨吸收的关键因子，一方面它可以通过促进破骨细胞的分化促进骨吸收，另一方面还可以抑制成骨细胞的分化而抑制骨形成。虽然目前关于LPS引起的骨稳态失衡的机制研究已经在广泛进行，但是对于LPS如何调控成骨细胞和破骨细胞的具体分子机制尚不十分清楚。近年来Eph/ephrin信号分子在骨重建过程的作用备受学者们关注。新近研究表明，破骨细胞和成骨细胞间的EphA2/ephrinA2信号分子在骨重建过程中，是启动骨吸收的重要信号分子。当成骨细胞和破骨细胞表面EphA2/ephrinA2发生接触后，破骨细胞接收的正向信号和逆向信号都能促进破骨细胞分化，加速骨吸收过程。经成骨细胞表面EphA2受体传导的正向信号能够抑制成骨细胞分化，抑制骨形成过程。随着骨组织局部微环境的变化而引起的成骨细胞和破骨细胞之间功能状态改变，最终实现由骨稳态向骨吸收的转变过程。但目前关于Pg-LPS是否通过EphA2/ephrinA2信号通路参与启动牙槽骨吸收过程国内外未见相关报道。本实验尝试在体外环境下通过使用Pg-LPS与MC3T3-E1细胞共培养，检测细胞表达EphA2的变化，初步了解Pg-LPS对EphA2/ephrinA2信号通路调控的影响。方法：使用浓度为1g/ml的Pg-LPS与MC3T3-E1共培养，分别在3、7、14d三个时间点，采用RT-PCR和Westernblotting技术分别检测EphA2和成骨相关基因的表达及EphA2蛋白质的表达，并通过PNPP法测定碱性磷酸酶活性。结果：1.RT-PCR结果显示：在Pg-LPS与MC3T3-E1细胞共培养后，实验组EphA2基因的表达比对照组明显增高。在Pg-LPS作用10min后，实验组EphA2基因的表达无明显差异。作用1h后，EphA2基因的表达最为明显。2.RT-PCR结果显示：在Pg-LPS与MC3T3-E1细胞共培养后，EphA2基因的表达在3d和7d时，实验组较对照组均有明显增加（P<0.01），其中3d组较7d组，EphA2基因的表达更为明显。但在14d时两组间EphA2基因表达无显著性差异。在3d和7d时，伴随着EphA2基因上调的同时，ALP和Sp7基因出现了显著下降（P<0.01），ALP基因在7d时下降最明显，在14d时ALP和Sp7的表达则无显著性差异。但是Pg-LPS对Runx2和ColⅠ基因的表达在3、7和14d时均无明显影响。3.Westernblotting结果显示：在Pg-LPS与MC3T3-E1细胞共培养后，在7d时实验组较对照组EphA2的表达明显增加，但是在3、14d两个时间点EphA2的表达无明显差异。4.ALP活性结果显示：在3、7、14d三个时间点，Pg-LPS都能够抑制碱性磷酸酶活性，其中3d时，对碱性磷酸酶活性抑制最明显，实验组比对照组降低35%（P<0.01）；在7d时，Pg-LPS的抑制作用最弱，实验组比对照组降低17%（P<0.05）。结论：1.在无成骨诱导的条件下，Pg-LPS能够促进MC3T3-E1细胞表达EphA2基因。2.在成骨诱导条件下，Pg-LPS在早期和中期能够抑制MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化，但是在晚期抑制作用不明显。3.Pg-LPS可能通过EphA2/ephrinA2信号通路参与调节MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化的过程。
【作者】王习超；
【导师】于维先；
【作者基本信息】吉林大学，口腔医学，2014，硕士
【关键词】Pg-LPS；成骨细胞；EphA2；

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