斑马鱼抗寒模型的构建及鱼类相关基因功能探讨

【摘要】许多鱼类都具有非常重要的经济价值，并是我国主要的水产养殖品种。目前环境变化加剧，气温波动大并时常出现严寒气候，带来鱼类越冬死亡率高、越冬成本加大等问题，严重制约了鱼类养殖业的健康发展。因此，建立鱼类抗寒机理研究模型，研究阐明鱼类抗寒基因调控网络及其作用机理具有重要的应用意义。本研究对抗寒相关候选基因进行分析，采用肌肉Ⅲ型肌酸激酶（m3ck）基因构建转基因斑马鱼，探讨了低温下可能发挥作用的分子调控网络；对谷胱甘肽巯基转移酶M（GSTM）基因进行了DNA序列多态性分析，筛选出与鱼类低温耐受性相关的SNP分子标记；并对牙鲆IV型抗冻蛋白（AFP-IV）基因进行体外蛋白重组表达，以期对其抗冻活性进行体外分析。主要研究结果如下：1、构建转基因质粒并通过显微注射方法获得了2个组织特异性转m3ck基因斑马鱼系，Tg(smyd1:m3ck)转基因鱼为骨骼肌特异性启动子smyd1驱动m3ck表达，Tg(cmlc:m3ck)转基因鱼为心肌特异性启动子cmlc驱动m3ck表达。将转基因鱼培养至F2代，其阳性率分别为34.90%（22/63）和58.75%（47/80）。低温处理后行为学观察结果显示，Tg(smyd1:m3ck)转基因鱼游动能力较好、身体偶有摆动、对外界刺激有应激性的鱼数目百分比均比野生斑马鱼显著增加（P<0.05），完全静止、身体出现翻转及死亡的鱼数目百分比均比野生斑马鱼显著减少（P<0.05）；Tg(cmlc:m3ck)转基因鱼仅表现为身体出现翻转的鱼数目百分比比野生斑马鱼显著减少（P<0.05）。生理指标检测结果显示，Tg(smyd1:m3ck)转基因鱼常温及低温下肌肉组织能量（ATP浓度）均比野生斑马鱼显著增加（P<0.05）；Tg(cmlc:m3ck)转基因鱼常温及低温下心脏组织能量与野生斑马鱼无显著差异。2、以Tg(smyd1:m3ck)转基因鱼为模型，借助表达谱芯片分析常温及低温下转基因鱼与野生鱼基因表达变化。Microarray检测到1249个差异转录本，GO分析及KEGGpathway分析发现转基因斑马鱼的低温诱导基因主要涉及类固醇生物合成和磷酸肌醇代谢途径。这些途径主要参与环境适应、信号转导和细胞膜构建等生物过程。野生型斑马鱼的低温诱导基因涉及MAPK信号通路、NOD受体信号通路、Toll样受体信号通路、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换等。此外，转基因鱼的低温抑制途径主要包括PPAR信号通路、细胞因子受体相互作用等途径，而野生斑马鱼包括原发性胆汁酸的生物合成、丙酮酸代谢、醚脂代谢和柠檬酸循环（TCA循环）等与能量代谢密切的生物过程。3、以Tg(cmlc:m3ck)转基因鱼为模型分析能量对心脏的影响。F2代野生斑马鱼幼鱼与转基因鱼幼鱼（48hpf）分别进行低温（13°C）及常温（28°C）处理，心脏搏动频率统计结果显示，常温下野生斑马鱼心率为152.88±4.01次/分，低温处理后显著下降为41.20±4.13次/分（P<0.01）；常温下野生斑马鱼心率为187.50±7.84次/分，低温处理后为87.82±9.71次/分，均比野生斑马鱼显著增加（P<0.05）。且低温下转基因斑马鱼心率可达野生斑马鱼的57.44%。对早期心脏发育模式进行分析，发现转基因斑马鱼心脏发育时期比野生斑马鱼有明显提前。4、运用PCR-SSCP技术对斑马鱼实验群体中低温耐受及低温敏感组进行GSTM基因多态性分析，在第1内含子中获得1个与低温耐受性状相关的多态位点，检测到DD、DE和EE3种基因型，共D、E2个等位基因，该群体的观测杂合度和期望杂合度分别为0.408和0.477，多态信息含量为0.362，在该位点符合Hardy-Weinberg平衡。连锁分析结果显示，这3种基因型与低温耐受性状显著相关（χ2=8.498，P<0.05）：DD基因型在耐低温群体中占优势（50.00%），并表现为对受低温胁迫斑马鱼的保护性因素（OR=0.520,95%CI=0.255-1.061），而DE基因型在不耐低温群体中占优势（51.31%），表现为低温胁迫下斑马鱼的危险因素（OR=3.012，95%CI=1.413-6.419）。研究结果为鱼类耐低温标记的筛选提供依据。5、在牙鲆cDNA文库中筛得IV型抗冻蛋白（AFP-IV）同源基因AFP-IV-1、AFP-IV-2。AFP-IV-1基因cDNA全长为652bp，其开放阅读框为375bp，编码124个氨基酸残基；AFP-IV-2基因cDNA全长为781bp，其开放阅读框为465bp，编码154个氨基酸残基。应用原核表达系统进行体外重组表达，AFP-IV-1重组蛋白得到成功表达，融合蛋白的分子量理论值为19.36kDaKDa，主要以可溶形式存在，少量以包涵体形式出现。当诱导4h、IPTG浓度为0.6mM时，重组蛋白表达量最大。对目的蛋白进行纯化，以期对其抗冻活性进行体外分析。综合上述结果，本研究对斑马鱼、牙鲆抗寒相关候选基因进行分析，揭示大量抗寒相关候选基因及低温下可能发挥作用的调控网络；筛选出1个与斑马鱼低温耐受性相关的SNP分子标记；并纯化出可能具有抗冻活性的重组牙鲆抗冻蛋白。研究结果不仅有助于解析鱼类耐抗寒基因调控网络及其作用机理，也可为鱼类耐低温标记的筛选及其在海水经济鱼类抗寒育种中的应用提供依据和参考。
【作者】王倩；
【导师】尤锋；
【作者基本信息】中国科学院研究生院（海洋研究所），海洋生物学，2014，博士
【关键词】转基因斑马鱼；基因芯片；PCR-SSCP；牙鲆抗冻蛋白；原核重组表达；

【参考文献】
[1]钱怡丰.旅游专业中高等职业教育有效衔接研究[D].宁波大学,教育管理（专业学位）,2014,硕士.
[2]周智强.内镜下不同大小气囊扩张十二指肠乳头治疗胆总管结石的研究[D].蚌埠医学院,外科学,2013,硕士.
[3]陈萌.法兰克福学派大众文化批判理论及其当代意义[D].贵州师范大学,国外马克思主义研究,2014,硕士.
[4]鄢静.我国都市成年人关于爱的隐含理论研究[D].华东师范大学,应用心理学,2004,硕士.
[5]翟承旭.“以人为本”与社会主义法治理念融合问题研究[D].西安科技大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[6]程文晶.G公司的重点近场通信（NFC）移动支付产品的市场营销研究[D].华东理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[7]冷玲.论宪法上的请愿权[D].西南政法大学,宪法学与行政法学,2012,硕士.
[8]于静,孙明武.永新地区高精度地震采集方法的应用效果[J].石油地球物理勘探,2008,S2:6-10+177+10.
[9]俞立,陈国定.具有闭环区域极点和方差约束的鲁棒输出反馈控制[J].自动化学报,2002,05:848-850.
[10]傅勤,杨成梧.含非匹配互联项的一类大型互联非线性系统的鲁棒分散控制[J].自动化学报,2008,04:488-492.
[11]谢颖.精氨酸在创伤、烧伤和大手术患者监测方法和作用机制研究[D].河北医科大学,营养与食品卫生学,2014,硕士.
[12]马晓羽.大学生未来时间洞察力对学业效能与成就动机关系的影响[D].吉林大学,应用心理,2014,硕士.
[13]宋　罡１,韩　意２.基于装备制造业产业集群的辽宁区域品牌建设研究[J].沈阳工业大学学报(社会科学版).
[14]朱兴曦.宁夏引黄灌区水稻节水控灌技术应用研究[D].西安理工大学,水利工程,2003,硕士.
[15]刘俊.源于实践的活力——山西省沁源县实行集体林股份制家庭托管的启示[J].绿色中国.2005(07)
[16]郭鹏.恒压型白光LED驱动电路研究与实现[D].浙江大学,2006.
[17]罗跃辉.车辆牵引力、速度与滑转率相关性研究[D].河南科技大学,车辆工程,2013,硕士.
[18]奚新春.浅析我国公司法中的独立董事与监事会双轨监督机制[D].复旦大学,法律,2012,硕士.
[19]尹海欣.混沌系统的控制与同步理论研究[D].燕山大学,控制理论与控制工程,2003,硕士.
[20]房建方.时间序列分段线性表示及定性趋势分析方法的研究[D].兰州理工大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[21]邓富求.偏移速度分析[J].石油地球物理勘探,1979,02:58-64.
[22]张曼.英美法中的间接证据理论及其借鉴意义[D].西南政法大学,诉讼法学,2012,硕士.
[23]殷小金.急性心肌梗死患者循环中三种候选microRNA的检测及临床意义[D].福建医科大学,内科学,2014,硕士.
[24]高仁福.基于工艺集成的开放式运动控制器设计[D].山东大学,机械电子工程,2013,硕士.
[25]侯婕.北京西山岩溶水可开采资源量评价[D].首都师范大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[26]常文静,郭大立.中国温带、亚热带和热带森林45个常见树种细根直径变异[J].植物生态学报,2008,06:1248-1257.
[27]邢德峰,任南琪.应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析[J].微生物学报,2006,02:331-335.
[28]李杰.新兴在线软件服务的用户接受影响因素研究[D].浙江大学,2008.
[29]胡浩枫.分数阶微分在数字图像增强中的应用研究[D].湘潭大学,计算数学,2011,硕士.
[30]于开真.课堂讨论法在初中物理教学中应用的研究[D].鲁东大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[31]李澍,张杰.网络传播社会主义核心价值观的途径[J].新闻与写作,2014,11:103-104.
[32]李世辉.赝科学提法的要害是混淆提出假说[J].科学对社会的影响.2002(03)
[33]咸星兰.高校知识型员工工作生活质量对组织绩效的影响研究[D].东北师范大学,企业管理,2012,硕士.
[34]任璐.偏头痛患者的静息态功能磁共振研究[D].河北医科大学,神经病学,2013,硕士.
[35]刘勇.基于Linux和中间件技术的电子商务系统研究[D].武汉理工大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[36]张天福.笼形倍半硅氧烷（POSS）对咔唑基共轭聚合物电致发光性能的影响[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[37]张兆萃.动产多重买卖中标的物所有权的归属[D].大连海事大学,民商法,2014,硕士.
[38]高龙,夏遂华,董平静.带观测器的外扰补偿器在双环调速系统中的应用[J].冶金自动化,1983,05:27-32.
[39]陈丽闽.草莓挥发性成分测定分析及菇渣基质开发[D].浙江大学,植物保护学（专业学位）,2012,硕士.
[40]韩啸天.链接推荐用于增强社交网络信息扩散方法研究[D].哈尔滨工业大学,计算机技术,2014,硕士.
[41]姜黎黎.中学语文教师的专业素养研究[D].延安大学,语文课程与教学论,2014,硕士.
[42]刘云璐,蒲菊华,方维维,熊璋.一种无线传感器网络MAC协议优化算法[J].计算机学报,2012,03:529-539.
[43]彭静.山羊耳尖成纤维细胞重编程为多能干细胞的研究[D].华中农业大学,动物遗传育种与繁殖,2014,硕士.
[44]方彰炎.混凝土轨枕裂损原因及其防治[J].铁道运营技术.1995(01)
[45]邰凡.快递服务中影响顾客购后行为的因素研究[D].浙江大学,2008.
[46]陈海鑫.二维浅水流动数值模拟研究及其应用[D].大连理工大学,水力学及河流动力学,2013,硕士.
[47]罗立红.生活地理教育的理论和实践[D].湖南师范大学,学科教学论,2004,硕士.
[48]林勇.新型功能化石墨烯的制备及其在橡胶中的应用[D].华南理工大学,2014.
[49]张文会.消费者信心与经济环境的互动关系研究[D].首都经济贸易大学,统计学,2014,硕士.
[50]沈涛.水平管外降膜蒸发流动与传热特性的数值模拟[D].大连理工大学,热能工程,2013,硕士.