去泛素化酶TNFAIP3在布鲁氏菌胞内生存中功能的初步研究

【摘要】布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌属(Brucella)的布鲁氏菌侵入机体，引起的人畜共患病。布鲁氏菌是胞内寄生菌，能引起哺乳动物的流产和不育，人感染布鲁氏菌后表现为持续性发热、全身乏力、关节疼痛等许多综合症状。布鲁氏菌的毒力主要是因为它能在宿主细胞内的生存及复制。布鲁氏菌主要寄生于机体的单核-巨噬细胞等细胞内。布鲁氏菌感染的初期，几乎不出现炎症反应，只释放少量的TNF-α和IL-6等炎症细胞因子，机体的天然免疫受到抑制；感染后期，逃避免疫监视，实现在巨噬细胞内的大量繁殖。有关布鲁氏菌感染引起的天然免疫抑制机制目前尚不清晰。因此，研究巨噬细胞感染布鲁氏菌的免疫调控具有极为重要的意义。去泛素化酶TNFAIP3又称锌指蛋白A20(zinefingerprotein,A20)，作为TLRs和NLRs信号途径中负向调控蛋白，能通过其双重的泛素化酶活性在NF-κB信号通路以及TNF-α介导的细胞凋亡信号通路中发挥负调控作用。前期研究工作表明：巨噬细胞感染布鲁氏菌后A20表达增加，但是具体的机制不明。为了研究布鲁菌感染机体后A20是否调节天然免疫，本课题通过分子生物学手段分别构建表达和沉默A20的慢病毒载体；重组慢病毒质粒、包装质粒、包膜质粒三质粒共转染到293T细胞包装慢病毒，转染48h后通过观察绿色荧光鉴定病毒包装是否成功；将包装好的病毒进一步感染J774A.1，Westernblot检测A20的表达；以LPS刺激细胞，Westernblot检测IκB-α降解变化且ELISA检测炎性细胞因子TNF-α及IL-6的水平来判定表达和沉默A20基因的细胞模型是否成功。用牛布鲁氏菌2308菌株分别感染表达和沉默A20基因的J774A.1细胞，并以感染正常J774A.1细胞为空白对照，侵染0h、4h、8h、12h、24h后，对胞内存活的布鲁氏菌进行计数，并用ELISA检测布鲁氏菌侵染48h后TNF-α的表达。通过CFU和细胞因子测定实验，确定A20在布鲁氏菌胞内生存及增殖中的功能。限制性内切酶酶切鉴定、DNA测序表明A20重组慢病毒质粒构建成功；慢病毒包装实验发现病毒转导细胞48h后可观察到许多发绿色荧光的细胞，表明A20重组慢病毒包装成功；Westernblot证实表达A20的重组慢病毒感染J774A.1后A20蛋白表达明显增加，LPS刺激后IκB-α未发生降解，TNF-α及IL-6水平明显低于空载体及空白对照组(P<0.01)。结果表明，本研究成功构建了A20表达的巨噬细胞模型。沉默A20的重组慢病毒感染J774A.1后，Westernblot结果显示A20表达明显下调，LPS刺激后促进了IκB-α的降解，TNF-α及IL-6水平明显高于空载体及空白对照组(P<0.01)。结果表明，本研究成功构建了沉默A20的巨噬细胞模型。布鲁氏菌感染A20过表达的巨噬细胞后，TNF-α水平明显低于空白组(P<0.01)。布鲁氏菌感染沉默A20的巨噬细胞后，TNF-α水平明显高于空白组(P<0.01)。细菌CFU实验表明，与对照组相比，布鲁氏菌感染稳转表达A20基因的巨噬细胞后，胞内细菌数增多，感染沉默A20基因的巨噬细胞后，胞内细菌数降低。综上所述，我们的实验结果表明，A20参与布鲁氏菌感染的天然免疫调节，并通过其负向调控作用调节布鲁氏菌的胞内生存。这为我们进一步研究A20如何通过其去泛素化功能来调节布鲁氏菌胞内生存的机制奠定了实验基础。
【作者】赵玉玺；
【导师】彭其胜；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】A20；巨噬细胞；天然免疫；布鲁氏菌；

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