猪血凝性脑脊髓炎病毒感染对树突状细胞表型及其免疫应答的影响

【摘要】猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus,PHEV）属于冠状病毒属成员，是引起猪血凝性脑脊髓炎的病原。PHEV在临床上主要感染1-3周龄的仔猪，以呕吐、衰竭或/和明显的神经症状为主要特征，死亡率高达20%-100%。PHEV具有典型的嗜神经性，由感染局部的外周神经向中枢神经系统传递，进而损伤中枢神经系统而出现典型的神经症状，但其致病的分子机制目前还不清楚。一般而言，机体的免疫系统在病原感染过程中都会发挥一定的防御作用，因此，开展机体的重要免疫细胞与PHEV的互作研究对于阐明该病毒的致病机制具有重要意义。树突状细胞（dendriticcell,DC）是目前已知的抗原提呈能力最强的细胞，同时也是适应性免疫应答的发起者。病原体可以利用各种方式干扰DC的功能，甚至可以逃避机体免疫系统的识别并感染DC，使DC成为高效复制病毒的场所，并且成为储存和扩散病原体的巢穴。为了明确DC在PHEV感染过程中发挥的作用，本论文开展了以下几个方面的研究工作。首先选择BALB/c小鼠作为实验动物，进行了小鼠骨髓源DC的分离培养。用无菌注射器从小鼠骨髓中冲洗出细胞，经40目细胞筛过滤细胞除去组织碎片和杂质，离心后加入红细胞裂解液除去红细胞，洗涤后细胞计数，按2×105/皿接种于24孔板，加入含有GM-CSF、IL-4和10%胎牛血清的RPMI1640营养液进行培养，培养过程中隔天换液。结果，第3天即可见有细胞集落，在高倍镜下可见细胞表面有树突状突起，符合DC细胞的形态学特点。分别取培养第7、10天的细胞进行DC表面分子CD11c的流式检测，其纯度分别大于达到55%和77%，说明成功分离培养高纯度的DC，可以满足后续实验。DC在发育、成熟及活化的不同阶段，其表型均发生一定程度的改变。为了明确PHEV刺激对DC细胞的影响，本试验用流式细胞仪进行了DC特异性表面标志物的检测分析。结果显示，PHEV刺激DC24h和48h，与对照组相比，其CD40、CD80的表达量明显增加，MHC-Ⅱ分子表达量也有所上调，但CD86变化不明显。由此可见，PHEV的刺激使DC趋于成熟，从而增加了DC的抗原递呈能力。同时，应用荧光定量PCR和免疫荧光染色方法对PHEV接种DC后不同时间点的病毒含量和分布情况进行的检测结果显示，在接种后72h的病毒含量较接种后24h的病毒量明显增加，说明PHEV可以感染DC并可在细胞内复制增殖。DC胞浆内的阳性荧光信号也证实了这一结果。为了明确PHEV作用后的DC分泌细胞因子的能力，本实验采用ELISA方法对PHEV感染后不同时间点的细胞上清液进行了IL-10、IL-12、TNF-α等的检测分析。结果显示，TNF-α和IL-12出现先升高后降低的特点，与对照组相比，IL-10的浓度随PHEV感染时间的延长而逐渐增加，到感染后72h达到3.6倍。IL-10对树突状细胞及其他细胞有广泛的生物学效应，其对IL-12和IFN-γ的产生具有一定的抑制作用，因此推测IL-10的升高导致了上述两种细胞因子在后期的表达量降低。IL-10具有诱导浆细胞分泌抗体形成的能力，这也是PHEV的感染增强了DC抗原递呈能力的一种体现。另外，IL-10可以上调共刺激分子CD40，CD80等的表达，这与PHEV作用后DC的表现变化结果相一致。脾脏淋巴细胞亚群比例（CD3+CD4+/CD3+CD8+）是反应机体免疫能力重要的指标，机体免疫能力增强则比值升高。本研究将分离的小鼠脾细胞与PHEV刺激不同时间段的DC共培养72h后，通过流式细胞仪对CD3+CD4+/CD3+CD8+进行了检测。结果，二者的比例先降低后升高，说明PHEV刺激后的DC在后期可以激活初始T细胞。本论文的研究结果不仅明确了DC在PHEV感染过程中的作用，为机体在病毒感染后的免疫应答和免疫调控机理研究提供了参考，而且为PHEV致病的分子机制研究奠定了基础。
【作者】刘立卓；
【导师】靳朝；
【作者基本信息】吉林大学，临床兽医学，2014，硕士
【关键词】猪血凝性脑脊髓炎病毒；小鼠；树突状细胞；免疫应答；

【参考文献】
[1]金盼盼.汽车非常规污染与甲醇含量测试方法研究[D].长安大学,载运工具运用工程,2013,硕士.
[2]张小红.黑龙江农民参加新型农村养老保险意愿研究[D].东北农业大学,金融学,2013,硕士.
[3]樊耀聪.情感因素在新闻传播中的应用[D].西北大学,广播电视（专业学位）,2014,硕士.
[4]任磊.桔梗药材、提取物多糖类成分及质量控制的研究[D].黑龙江中医药大学,中药学,2014,硕士.
[5]刘冰.氮化镓异质结电子输运特性的研究[D].北京交通大学,2013.
[6]周可瑜.长春市湖东社区社区体育特点研究[D].吉林大学,体育教学,2013,硕士.
[7]陈兵,谢运祥,宋静娴.30°～390°矢量模式单周控制三相三线制三电平APF[J].电力系统自动化,2007,21:76-81.
[8]A.Arrow,陈德源.高性能防空战术导弹从优定向控制的现状和有关问题[J].现代防御技术.1985(03)
[9]耿广威.析氯析氧催化电极的制备及其性能研究[D].郑州大学,物理化学,2013,硕士.
[10]莫晓东.前列腺穿刺活检患者中测定血清高敏C反应蛋白的临床意义[D].苏州大学,泌尿外科学,2013,硕士.
[11]贺炜,潘泉,陈玉春,张洪才.关联规则挖掘与因果关系发现的比较研究[J].模式识别与人工智能,2005,03:328-333.
[12]席杰,杨军,朱学平.带落角和导引头视角约束的制导律设计[J].电光与控制,2014,09:26-28+89.
[13]罗姗姗,彭鹏,毛亚胜,金乃正,沈水明.基于光纤通信的多端线路电流差动保护装置[J].电力系统自动化,2006,09:50-55.
[14]凌岩雄.服务外包在海外服务能力建设中的应用[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[15]姜永波,孙向成.基于数据挖掘的客户关系管理[J].中国科技信息,2005,09:202.
[16]郑金城.云梯搬家车结构设计及梯架系统优化[D].哈尔滨工业大学,车辆工程,2014,硕士.
[17]张兴兰.税源监控问题研究[D].西南财经大学,2004.
[18]李鹏.草炭对土壤理化性状及烟叶品质的影响[D].湖南农业大学,作物,2012,硕士.
[19]梁晓华.视角的创造：色彩斑斓的历史画像[D].河南大学,中国现当代文学,2004,硕士.
[20]姜嘉楠.直板横打与横板反手弧圈球技术差异性的运动学分析[D].沈阳体育学院,体育教育训练学,2014,硕士.
[21]尚晨曦.学术专著汉译中的句法策略[D].河北师范大学,翻译,2014,硕士.
[22]李星.归因理论视角下中国—东盟区域合作中的信任问题研究[D].中共江苏省委党校,国际政治,2013,硕士.
[23]隋移山.利用期刊资源提供知识服务[J].大学图书情报学刊,2003,01:57-59.
[24]肖冠宇.基于突发中断条件的城市轨道交通应急客流疏运研究[D].西南交通大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[25]庞乐君.基因组学和蛋白质组学对新药研发的影响[D].中国人民解放军军事医学科学院,2005.
[26]王帆.基于虚拟仪器的过/欠压保护器功能测试系统的设计与实现[D].苏州大学,计算机技术（专业学位）,2014,硕士.
[27]张亚南.DEM分辨率确定与尺度转换方法研究[D].南京师范大学,地图学与地理信息系统,2014,博士.
[28]何樵登,杨宝俊.叙率滤波的理论和应用[J].石油地球物理勘探,1980,06:17-25.
[29]黄琼华.miRNA-146a、miRNA-196a2基因多态性与广西壮族人群原发性肝癌的相关性研究[D].广西医科大学,肿瘤学,2013,硕士.
[30]梁宁.信息与无线技术在运输管控系统中的应用[J].冶金自动化,2011,02:30-35.
[31]于波.吉林地区农民住宅空间设计与研究[D].长春工业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[32]马驰.货币政策对我国上市银行经营绩效影响研究[D].江西财经大学,金融学,2013,硕士.
[33]徐旭磊.ABC（中国）公司员工福利诊断及优化设计[D].上海外国语大学,工商管理,2013,硕士.
[34]杨新武,刘椿年.基于信息赢取的适应度函数[J].计算机工程,2004,02:38-39+161.
[35]彭祝杰.计及分布式电源的配电网可靠性评估[D].湖南大学,电气工程,2011,硕士.
[36]王款.郑州廉政网络受众度研究报告[D].郑州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[37]赵丽燕.膈下逐瘀冲剂治疗不孕症之输卵管炎的临床疗效观察[D].黑龙江中医药大学,中医妇科学（专业学位）,2014,硕士.
[38]张蓉.“反胜为败”和“反败为胜”情境下跳水运动员赛前行为程序的比较[D].天津体育学院,体育教育训练学,2014,硕士.
[39]王慧聪.引入平衡计分卡的全面预算管理研究[D].首都经济贸易大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[40]徐松柏.基于跟踪反馈的相控阵雷达宏微观资源管理技术研究[D].杭州电子科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[41]王玉宁.海上保险条款的法律规制研究[D].大连海事大学,海商法,2014,硕士.
[42]李杰.基于图像相关法的砂土直剪试验及其颗粒流数值模拟[D].青岛理工大学,工程力学,2012,硕士.
[43]张化.美国加州的水权和水争[D].河北师范大学,世界史,2014,硕士.
[44]徐则民,黄润秋,范柱国,吴培关.长大隧道岩爆灾害研究进展[J].自然灾害学报,2004,02:16-24.
[45]刘奇.Web环境下的Modelica建模与仿真平台框架及关键技术研究[D].华中科技大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[46]熊阿伟.校园在线图书销售平台研究与设计[D].南昌大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[47]毕婷.反倾销应诉中的会计问题研究[D].北京交通大学,2014.
[48]徐凤.基于Visual MODFLOW的西南岩溶区某项目地下水污染运移模拟研究[D].合肥工业大学,环境工程（专业学位）,2014,硕士.
[49]刘宏芳.光合细菌降解苯酚的研究[D].山西大学,环境科学,2004,硕士.
[50]武淑平.电力企业生产中人因失误影响因素及管理对策研究[D].北京交通大学,2009.