KIR基因对异基因造血干细胞移植预后的影响及其机制研究的初步探讨

【摘要】第一部分KIR基因型、单倍型和受配体模式分析对异基因造血干细胞移植预后的影响目的：建立杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killercellimmunoglobulinreceptor，KIR)基因型、单倍型及受配体缺失模式，分析其对异基因造血干细胞移植(allogeneichemotopoieticstemcelltransplantation,allo-HSCT)预后的影响。方法：采用序列特异性引物聚合酶链反应方法，对进行HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1高分辨的供、受者进行KIR检测，建立三种KIR分型模式(供受体KIR基因模式、KIR/HLA受配体缺失模式、供体KIR单倍体模式)。结果：1.供受体KIR基因模式：即供者与受者KIR受体基因是否相合。当供受者KIR基因型完全相合时，即为供受体KIR基因相合。当供受者KIR不完全相合时即为供受者KIR基因错配。2.供受体KIR/HLA受配体模式分析：当受者缺乏与供者KIR相合的HLA配体时即为供受体KIR/HLA受配体缺失模式。3.KIR单体型分型：①A单体型：以抑制性KIR(iKIR)为主，仅有唯一的激活性KIR为KIR2DS4，KIR2DS4可进一步分为2DS4完整型、2DS4完整/缺失型、2DS4缺失型三组亚型；②B单体型：包含多种激活性KIR(aKIR)(KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR3DSl)的不同组合。KIR-A/A基因型仅包含A单体型，KIR-A/B基因型同时包含A单体型和B单体型，KIR-B/B基因型仅包含B单体型，A/B基因型和B/B基因型合称为B/x基因型。A/A基因型可分为AA-1(完整型)，AA-2(完整/缺失型)和AA-3(缺失型)。B单体型可分为15种不同的单体B1–B15。KIR单倍体根据其基因在着丝粒(centromeric，Cen)和端粒端(telomeric，Tel)的分布可进一步分析。结论：供受体KIR基因型模式、供受体KIR/HLA受配体模式及供体KIR单倍体模式的建立对于分析KIR基因对异基因造血干细胞移植预后的影响具有重要意义。第二部分KIR基因对恶性血液病患者同胞HLA全相合造血干细胞移植预后的影响目的：探讨KIR基因型及单倍型对同胞全相合造血干细胞移植的影响。方法：采用序列特异性引物聚合酶链反应方法，对219对HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1高分辨基因分型全相合的同胞供、受者进行KIR基因分型，分别应用供受体KIR基因模式、KIR/HLA受配体缺失模式、供体KIR单倍体模式及其着丝粒(Cen)和端粒端(Tel)分析KIR对同胞全相合造血干细胞移植预后的影响。结果：2005年3月~2012年10月在苏州大学附属第一医院接受同胞HLA全相合造血干细胞移植的219例患者中，男性120例，女性99例。其中AML111例，MDS17例，ALL40例，CML33例，NHL18例。中位年龄38岁(8岁~63岁)。中位随访时间14月(3月~93月)，6例失访。所有患者均接受清髓性预处理。192例患者接受BuCy预处理，27例患者接受TBI+Cy预处理。回输干细胞量CD34+细胞：3.79(1.36-12.0)×106/kg。五年总生存率(OS)为76.2%，无复发生存率(RFS)为69.6%。AML/MDS,ALL和CML的OS分别为72.7%，67.9%和93.5%(P=0.156)。在供受体KIR基因模式中，供受体KIR基因不合组5年OS明显高于相合组(87.3%vs.69.3%;P=0.0268)，Ⅲ-Ⅳ急性GVHD低于相合组(4.6%vs.13.6%;P=0.029)。在KIR/HLA受配体缺失模式中，受体HLA为C1组与C2组比较，急性GVHD的发生率明显下降(23.2%vs.43.2%;P=0.002),在AML患者中效果更显著(21.5%vs.49.0%;P=0.001)。在供体KIR单倍型模式中，供体KIR基因型为Bx1者预后最差，和供体KIR基因型为其他Bx类型比较，其OS(100.0%vs.64.5%;P=0.0013)和RFS(100.0%vs.62.2%;P=0.0005)明显降低。而Bx1基因型的B单倍体位于端粒端，故进一步分析KIR的B单倍体位于端粒端和着丝粒端时对预后的影响。结果显示当供体KIR含有着丝粒端的B单倍体(Cen-B)时，移植的预后较好，OS(96.6%vs.72.0%;P=0.0169)和RFS(96.9%vs.61.3%;P=0.0056)明显提高，且复发率明显下降(2.9%vs.15.7%;P=0.047)。同胞HLA全相合造血干细胞移植CMV感染率为34.2%(75/219)，中位感染时间为62天(26~265天)，其中CMV病毒血症发生率为4.6%(10/219)，3例患者发生CMV肺炎。供受体KIR基因相合组中受体移植后CMV激活发生率35.6%(47/132)，不合组CMV激活发生率32.2%(28/87)，两组间无统计学差异(P=0.663)。供体KIR基因为A/A型，受体移植后CMV激活发生率39.5%(49/124)，供体KIR基因为A/B型，CMV激活发生率30.3%(23/76)，供体KIR基因为B/B型，CMV激活发生率15.8%(3/19)。供体KIR基因为A/A型与B/B型比较，两者有统计学意义(P=0.036)。供体KIR含Tel-B时，移植后CMV激活发生率为24.4%(20/82)，明显低于供体无Tel-B时CMV激活率40.1%(55/137)(P=0.017)。多因素分析提示供体KIR含Cen-B时OS(HR,8.293;95%CI,1.072–64.169;P=0.043)和RFS(HR:11.63;95%CI,1.51–89.566;P=0.018)明显提高，其作用主要体现在对复发的保护作用(HR,4.363;95%CI;1.184–16.08;P=0.027)。而受体HLA为C2是发生急性GVHD的危险因素(HR:0.316,95%CI:0.160–0.625,P=0.001)。分析KIR基因在ALL和CML患者移植的预后，其作用无统计学意义。结论：同胞全相合造血干细胞移植是治疗恶性血液病的重要手段，但移植的预后却存在很大差异。本研究对KIR基因B单倍体进行着丝粒及端粒端分析，并第一次分析其对同胞HLA全相合造血干细胞移植预后的影响，结果提示供体KIR含有Cen-B时对复发有保护作用，从而提高生存率，改善预后。供受体KIR基因不合可改善同胞全相合造血干细胞移植的预后。在KIR/HLA受配体缺失模式中，受体HLA为C2是发生急性GVHD的危险因素。而上述KIR的作用在AML患者中效果更显著。第三部分建立KIR/HLA受配体缺失体外模式及激活性KIR2DS4基因高表达的机制研究目的：建立体外KIR-A/A型的自然杀伤(NK)细胞与树突状细胞(DC)共培养的模型，分析aKIR2DS4高表达的机制。方法：检测受体HLA分型，分为HLA-C1组(C1/C1)和C2组(C1/C2和C2/C2)，在分选供体NK细胞前5~7天进行受体外周血单个核细胞衍生而来的DC培养；检测供体KIR基因，挑选KIR基因型为AA-1或AA-2的供体为实验组，KIR-A/B(2DS4Ful或Ful/Del)为对照组，分选供体CD3–CD16+CD56+NK细胞与DC共培养16~24小时，观察结果。结果：供体NK细胞与受体DC细胞共培养后，当浓度达2.5:1及以上时，2DS4表达增高。在KIR-A/A组中，当NK细胞:DC细胞浓度达2.5:1及以上时，与NK(加IL-2)比较，2DS4表达明显升高(P=0.002)，而在KIR-A/B组中无此规律。供体为KIR-AA-1者NK细胞表面2DS4阳性率(74.4±14.8)%，AA-2者2DS4阳性率(37.7±30.6)%，两者有统计学差异(P=0.030)。当NK细胞与DC细胞按2.5:1共培养后，AA-1者2DS4表达升高(P=0.006)，按5:1共培养后，AA-1者2DS4表达升高(P=0.003)；AA-2者NK细胞与DC细胞按5:1共培养后2DS4表达也有升高(P=0.027)。NK细胞与C1组DC细胞共培养后，与NK(加IL-2)组相比，2DS4表达明显升高(P=0.009)，而与C2组DC细胞共培养后，2DS4表达略有升高，但无统计学意义(P=0.435)。结论：本实验成功建立了KIR/HLA缺失的体外模型，并且证实当KIR/HLA发生错配时，活化型受体CD3–CD16+CD56+NK细胞直接杀伤靶细胞的异源反应活性增强，为前期的临床研究提供了理论依据，同时也为下一步NK细胞的功能试验奠定了基础。
【作者】周惠芬；
【导师】吴德沛；何军；
【作者基本信息】苏州大学，血液病学，2014，博士
【关键词】KIR；异基因造血干细胞移植；基因型；单倍体；受配体缺失模式；同胞；Cen-B；Tel-B；2DS4；

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