Calpain介导小鼠心肌缺血/再灌注氧化应激诱导的细胞凋亡机制研究

【摘要】目的：探讨钙蛋白酶（Calpain）在小鼠心肌缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）损伤氧化应激介导的细胞凋亡的作用机制。方法：采用结扎/松解左冠状动脉前降支（leftanteriordescendingcoronaryartery,LAD）的方法建立小鼠心脏缺血/再灌注模型。分假手术组（Control）、I/R组（冠状动脉闭塞45min，再灌注3h）、PD+I/R组（I/R前30min静脉注射calpain抑制剂—PD1506061mg/kg）。各组再灌注结束后，采用EvensBlue和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TriphenylTetrazoliumChloride,TTC）双染色，测定心肌梗死面积；原位末端转移酶标记技术(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnickendlabelingassay，TUNEL)、酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）测定胞浆细胞色素C（CytochromeC，CytC）含量、分光光度法测定caspase-3活性，以评估心肌细胞凋亡水平。体外分离、培养成年小鼠心肌原代细胞，建立缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation，H/R）模型，模拟在体I/R损伤，分对照组（Control）、H/R组（缺氧20min，复氧2h）、PD+H/R组（H/R前给予含25μMPD150606的培养液预处理30min）。台盼蓝拒染法测定细胞活性，ELISA检测胞浆CytC含量以及分光光度法测定caspase-3活性，以评估心肌细胞凋亡水平；试剂盒检测Calpain活性；通过高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）评估心肌细胞内ROS产量。结果：1动物实验1.1心肌梗死面积：EvensBlue和TTC双染色结果显示，与I/R组相比，虽然危险区无明显变化，但PD150606预处理能显著降低心肌梗死面积（P<0.05）。1.2TUNEL染色：I/R组TUNEL染色阳性率显著升高（P<0.01），而PD+I/R组TUNEL染色阳性率显著低于I/R组（P<0.05）。1.3胞浆CytC水平：与假手术组比，I/R组小鼠心脏梗死周围区域CytC胞浆水平显著增加（P<0.01）；PD+I/R组与I/R组相比，胞浆CytC水平明显降低（P<0.05）。1.4Caspase-3活性：I/R组caspase-3活性明显增加（P<0.01）；PD+I/R组与I/R组相比，caspase-3活性明显降低（P<0.05）。2细胞实验2.1细胞存活率：模拟缺血/再灌注使心肌细胞发生皱缩，细胞数量明显减少，搏动明显减弱、减慢；台盼蓝染色计算细胞存活率，H/R组心肌细胞活力明显降低(P＜0.01)；PD150606预处理能够一定程度的逆转上述现象。2.2Calpain活性：缺氧/复氧后，心肌细胞内Calpain活性明显增加（P<0.01），而PD150606预处理能有效抑制缺氧/复氧所致的Calpain活性增加。2.3胞浆CytC水平：与对照组相比，H/R组心肌细胞胞浆CytC水平显著增加（P<0.01）；而PD150606预处理后，胞浆CytC水平明显降低（P<0.05）。2.4Caspase-3活性：H/R组caspase-3活性明显增加（P<0.01）;PD+H/R组与H/R组相比，caspase-3活性明显降低（P<0.05）。2.5H/R组ROS产生率明显增加（P<0.01），而PD150606预处理能减少缺氧/复氧所致的心肌细胞氧化应激。结论：心肌缺血/再灌注时，Calpain活化，心肌细胞凋亡，引起缺血/再灌注损伤；而且Calpain活化引起的缺血/再灌注损伤与氧化应激，ROS产生增多有关。Calpain抑制剂PD150606能有效减轻缺血/再灌注损伤介导的氧化应激，减少心肌细胞凋亡，减小心肌梗死面积，保护心肌细胞免受缺血/再灌注损伤。因此，Calpain的化学抑制或生理性Calpain抑制剂表达上调或将成为治疗缺血性心脏疾病的一种行之有效的方法。
【作者】张双；
【导师】胡厚祥；
【作者基本信息】川北医学院，内科学，2014，硕士
【关键词】心脏；Calpain；缺血/再灌注；凋亡；活性氧；

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