GATA-4基因转染促进骨髓间充质干细胞心肌分化和血管形成的研究及机制探讨

【摘要】第一部分MSC的分离培养及GATA-4基因的转染目的：基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)是增加细胞抗缺氧和心肌分化的新方向。分离、培养和纯化大鼠MSC，以逆转录病毒为载体将GATA-4基因转染MSC，建立稳定的GATA-4基因修饰的MSC细胞模型。方法：从雄性大鼠骨髓中分离MSC，培养至第3代MSC，经pMSCV逆转录病毒表达系统转染GATA-4基因(MSCGATA-4)，对照组为仅表达GFP的空质粒组（MSCNull）。通过实时定量聚合酶链反应(Real-timequantitativepolymerasechainreaction,Real-timePCR)、Westernblot印迹和免疫组化的方法鉴定GATA-4基因转染的效果。结果：MSCGATA-4组GATA-4mRNA和蛋白表达明显高于对照组MSCNull，P<0.05。Real-timePCR数据显示，MSCGATA-4组GATA-4mRNA的表达是MSCNull组的258倍。通过免疫组化检测发现，虽然MSCGATA-4组和MSCNull组的GFP都显示阳性，但只有MSCGATA-4组细胞核呈GATA-4阳性表达。结论：本研究成功建立了GATA-4基因修饰MSC的培养系统，为进一步探讨GATA-4在MSC的心肌分化及血管新生中的作用奠定了基础。第二部分GATA-4基因转染促进MSC向心肌分化的研究及机制探讨目的：GATA-4是心肌转录因子，在心肌分化中起着重要的作用。我们从体外研究了GATA-4转染MSC是否促进其分化为心肌样细胞。方法：（1）分离和培养新生大鼠心室肌细胞（CM）。并通过光镜、透射电镜和免疫组化鉴定心肌细胞；（2）MSCGATA-4与CM共培养1周，通过Real-timePCR和Westernblot检测其心肌基因BNP、α-actinin和Islet-1的表达情况。（3）通过免疫荧光α-actinin染色法检测MSCGATA-4组和MSCNull组的心肌分化情况。（4）通过膜片钳技术检测MSCGATA-4组和MSCNull组细胞的电生理特点：分别记录内向整流性钾流（Ik1）、瞬时外向性钾流（Ito）、延迟整流性钾流（IKDR）、L-型钙离子流（ICa-L）、TTX敏感的钠离子流（INa.,TTX）和动作电位（AP）的表达，（5）通过流式细胞仪器检测MSCGATA-4组和MSCNull组心肌分化率的情况。（6）用Microarray、Real-timePCR和Westernblot检测MSCGATA-4组和MSCNull组胰岛素样生长因子结合蛋白（Insulin-LikeGrowthFactorBindingProtein,IGFBP-4）的表达。（7）为了研究IGFBP-4对GATA-4调节MSC的心肌分化作用，我们进行了MSCGATA-4组的IGFBP-4基因敲除，以scrambledsiRNA作为阴性对照组。并用Real-timePCR和Westernblot检测IGFBP-4基因敲除效果。（8）观察敲除IGFBP-4基因后，GATA-4对MSC心肌分化的作用。结果：（1）MSCGATA-4组的心肌基因BNP、α-actinin和Islet-1的表达明显高于对照组（转染空质粒组MSCNull）(P<0.05)。（2）MSCGATA-4组记录到表达高水平的Ik1、Ito、IKDR、ICa-L和INa.,TTX。与MSCNull组相比较，它们的电流密度明显增加，P<0.05。（3）MSCGATA-4与CM和共培养时，部分细胞记录到低幅度的动作电位（AP）；而MSCNull组没有记录到AP。（4）共培养7天后，部分GFP+的MSC细胞表达α-actinin。MSCGATA-4组（34％±4％）的阳性率与MSCNull组（15％±2％）相比较，明显增加，P<0.05。（5）通过Microarray、Real-timePCR和Westernblot检测，IGFBP-4表达在MSCGATA-4组较MSCNull组明显增加，P<0.05。（6）经siRNA敲除IGFBP-4基因后，定量PCR显示IGFBP-4-siRNA-MSCGATA-4中IGFBP-4基因的表达仅是MSCGATA-4组的38%(P<0.05)，Westernblot显示IGFBP-4-siRNA-MSCGATA-4细胞中IGFBP-4蛋白表达明显减少，只有MSCGATA-4组的28%(P<0.05)。（7）IGFBP-4基因敲除后，IGFBP-4-siRNA-MSCGATA-4细胞中心肌基因(BNP、α-actinin和Islet-1)的表达，与MSCGATA-4组相比较，显著减低，P<0.05。（8）通过流式细胞仪检测各组MSC的心肌分化率。结果显示，MSCGATA-4组的心肌分化率(34.09±4.65%)明显比MSCNull组心肌分化率(14.54±1.62%)增高，P<0.05。而IGFBP-4基因沉默以后，沉默组（IGFBP-4-siRNA-MSCGATA-4）的心肌分化率(16.87±1.98%)明显比MSCGATA-4组低（P<0.05）。（9）功能研究表明当敲除IGFBP-4基因时，MSCGATA-4组分化潜能被降低。结论：GATA-4过表达可以促进MSC分化为心肌样细胞，其机制可能与IGFBP-4的表达上调有关。第三部分GATA-4基因转染促进MSC新生血管形成的体外和体内研究目的：干细胞移植入受体心脏后，可以释放可溶性因子，增加心肌修复和血管再生。我们假设GATA-4过表达于MSC中可以通过增加其旁分泌作用，促进血管新生和细胞存活，从而改善心肌梗死后的心肌再生。方法：（1）用ELISA方法检测不同组细胞（MSCNull和MSCGATA-4组）上清中生长因子VEGF、IGF-1和b-FGF的表达。（2）用定量PCR方法检测不同组细胞中VEGF、IGF-1和b-FGF基因的表达情况。（3）为了检测细胞在缺氧条件下抵抗作用，细胞分别被缺氧不同时间24、48和72小时，用MTT观察细胞的增殖情况。（4）用绿色荧光的PKH67标记人脐静脉内皮细胞（HUVEC）；用不同组MSC细胞培养上清刺激HUVEC，体外观察不同组的毛细血管样结构的形成。同时加入VEGF或和IGF-1的中和抗体，孵育12小时，观察对毛细血管样结构形成的影响。（5）把HUVEC细胞球体接种到3D立体胶培养系统，加入细胞培养上清，同时加VEGF或和IGF-1的中和抗体作用24小时，观察对球体出芽的数量和总长度的影响。（6）用结扎冠状动脉左前降支的方法建立雌性大鼠的急性心肌梗死模型，各组MSC被注射到梗死周边区域的心肌内。（7）用定量PCR检测雌性大鼠中雄性Sry基因的表达，检测缺血心肌中MSC的存活。（8）用超声心动图评估心肌功能，同时检测新生血管的形成及梗死面积等。结果：（1）定量PCR的结果显示，MSCGATA-4组中VEGF和IGF-1基因的表达明显比MSCNull组表达高，P<0.05。（2）ELISA结果显示，在MSCGATA-4上清中VEGF和IGF-1的分泌明显比MSCNull上清高，P<0.05。b-FGF的分泌没有显著性差异，P＞0.05。（3）细胞缺氧48和72小时时，MTT细胞增殖明显减小。而GATA-4过度表达可以部分预防MTT的减小。（4）用MSCGATA-4组上清处理的HUVEC，与对照组MSCNull相比较，显著增加了血管样结构的形成和HUVEC的迁移（通过每个球体出芽的数量和出芽的总长度来评估），P<0.05。将中和抗体VEGF、IGF-1分别或同时加入到MSCGATA-4组中，可以明显减少MSCGATA-4组新生毛细血管的形成，与不加抗体的MSCGATA-4组相比较，P<0.05。（5）通过Sry基因的检测，在MSCGATA-4治疗组的梗死及梗死周边区，Sry基因的表达明显增高；与MSCNull组或MSCbas组相比较，有显著性的差异，P<0.05。可见过度表达GATA-4可以明显增加MSC在缺血心肌的存活率。（6）通过心脏超声检查，用MSCGATA-4移植治疗的动物组心功能明显改善；与MSCNull组或MSCbas组相比较，有显著性的差异，P<0.05。（7）通过组织化学染色可见，MSCGATA-4组血管密度增加，心梗面积降低；与MSCNull组或MSCbas组相比较，有显著性的差异，P<0.05。结论：GATA-4过表达于MSC，可以增加缺血心肌的MSC存活和新生血管的形成，是心肌梗死的一个有效的治疗方法。
【作者】李红霞；
【导师】杨向军；
【作者基本信息】苏州大学，心血管内科学，2014，博士
【关键词】GATA-4；骨髓间充质干细胞；心肌分化；血管形成；基因工程；

【参考文献】
[1]楼燕,郑金琪,胡海红,王临润,张幸国,胡云珍,曾苏.高效液相色谱-质谱法测定大鼠尿、粪便中狼毒色原酮的含量及其排泄研究[J].中国药学杂志,2014,01:68-75.
[2]陈琼.未成年人缓刑适用中存在的问题及完善[D].湖南师范大学,刑法学,2013,硕士.
[3]韩荣霞.活性粉末混凝土在氯盐和冻融循环耦合作用下的耐久性研究[D].北京交通大学,结构工程,2013,硕士.
[4]于福江.基于MAP框架的改进图像超分辨率重建算法研究[D].西安电子科技大学,光学工程,2013,硕士.
[5]钟雪燕.基于FPGA的SpaceWire路由器的设计与验证[D].南京航空航天大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[6]杨国良.直接转矩控制在异步电动机软起动中的应用研究[D].辽宁工程技术大学,电力电子与电力传动,2012,硕士.
[7]J.E.克雷尔伯特.地球物理资料处理基础[J].石油地球物理勘探,1978,03:67-79.
[8]姜启源,孙义军.ARMAX模型两种自适应k步超前预报形式的比较[J].自动化学报,1993,05:544-551.
[9]杨建华.华中电网一次调频考核系统的研究与开发[J].电力系统自动化,2008,09:96-99.
[10]曹立伟.时域MIMO信道测量平台设计与通信模块实现[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[11]赵静.企业预算松弛影响因素研究[D].河北经贸大学,会计学,2012,硕士.
[12]杨国蓉.“杜拉拉”的生产与消费[D].西北师范大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[13]宋沁青.R&D会计制度变更对企业研发投入的影响研究[D].南京农业大学,会计,2013,硕士.
[14]石培琴.我国区域基本公共服务均等化研究[D].财政部财政科学研究所,财政学,2014,博士.
[15]于开明.巴基斯坦俾路支问题研究[D].西北大学,国际关系,2014,硕士.
[16]冯秀梅.从切斯特曼翻译规范理论角度看非虚构类传记翻译[D].北京外国语大学,翻译,2014,硕士.
[17]李小平.红枣多糖提取工艺研究及其生物功能初探[D].陕西师范大学,食品科学,2004,硕士.
[18]周文.基于概念的若干知识表示模型及相关方法研究[D].上海大学,2007.
[19]陈洁茹.江西新闻出版职业技术学院网络自主学习系统设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[20]刘伟辉.老年人托管中心室内外活动空间规划与设计研究[D].苏州大学,艺术设计（专业学位）,2012,硕士.
[21]彭晓亮.准一维铁磁自旋模型中的反铁磁阻挫效应[D].扬州大学,理论物理,2012,硕士.
[22]李伟杰.基于UWB信号室内定位系统性能优化研究[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[23]郭钰,郭丽伟,陈小龙,贾玉萍,芦伟.六方晶型碳化硅硅面台阶高度对外延石墨烯性能的影响[A].中国物理学会X-射线衍射专业委员会、中国晶体学会粉末衍射专业委员会、国家自然科学基金委员会工程与材料科学部、北京市硅酸盐学会、中国科学院物理研究所、InternationalCentreforDiffractionData,USA.第十一届全国X射线衍射学术大会暨国际衍射数据中心（ICDD）研讨会论文摘要集[C].中国物理学会X-射线衍射专业委员会、中国晶体学会粉末衍射专业委员会、国家自然科学基金委员会工程与材料科学部、北京市硅酸盐学会、中国科学院物理研究所、InternationalCentreforDiffractionData,USA:,2012:1.
[24]张树增,苏蔷.建设TMIS培训基地培养更多更好的人才[J].铁路计算机应用.1997(03)
[25]李玲.基于薄膜ITO微电极监测SH-SY5Y细胞电化学行为研究[D].华东师范大学,分析化学,2013,硕士.
[26]关兴华.含环氧侧基酚酞聚芳醚酮的合成及性能研究[D].长春工业大学,材料学,2013,硕士.
[27]郭晓涛,黄宇豪,余淑贤,骆海萍,张仁铎,刘广立.石墨烯及氧化石墨烯对MFC启动特性及阳极菌落的影响研究[A].中国化学会.2014年第12届全国水处理化学大会暨学术研讨会论文摘要集[C].中国化学会:,2014:1.
[28]HeQin.从荣格分析心理学探析《欢乐之家》中丽莉巴特个性化失败的成因[D].西安外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[29]王潇然.泰国东北部那塞披他亚珊中学汉语教学现状调查与分析[D].苏州大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[30]刘晓东,徐翊华,于吉红,李激扬,庞文琴,徐如人.微孔晶体合成反应数据库的数据挖掘研究[J].复旦学报(自然科学版),2003,06:869-874.
[31]秦鹏.基于分形滤波的精密磁悬浮陀螺观测值降噪研究[D].长安大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.
[32]蔺万峰.新型硫族半导体光催化材料的合成、结构及性能研究[D].南昌航空大学,应用化学,2013,硕士.
[33]曹冉.公司内部治理机制、市场竞争与自愿信息披露研究[D].山东财经大学,会计学,2013,硕士.
[34]刘敏.油茶DGAT1基因的表达和功能研究[D].中南林业科技大学,经济林,2014,硕士.
[35]张大鹏.哈尔滨地区玉米蚜虫发生规律研究[D].黑龙江大学,农业推广,2012,硕士.
[36]魏伟.生活化作文教学研究[D].苏州大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[37]包洁琼.胎儿继承利益保护研究[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[38]黄启俊.RE（Gd,Nd）-Co-Al非晶合金的玻璃形成能力及磁性能研究[D].南京理工大学,材料工程,2013,硕士.
[39]王丽倩.双侧骨盆漏斗韧带悬吊术治疗绝经后重度盆腔器官脱垂的临床研究[D].遵义医学院,妇产科学（专业学位）,2013,硕士.
[40]许静.初二物理课堂教学中培养学生元认知能力的研究[D].曲阜师范大学,课程与教学论,2004,硕士.
[41]方师师.中国社会网络中的动态媒介过程：关系、结构与意义[D].复旦大学,新闻学,2013,博士.
[42]程汉龙.CFETR遥操作转运车的设计及其部件的分析优化[D].中国科学技术大学,核能科学与工程,2014,硕士.
[43]杨超.带内泵浦大功率MHz腔倒空锁模激光技术研究[D].北京工业大学,2014.
[44]耿进飞.基于ARM的多协议矿用网关设计与实现[D].中国矿业大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[45]曹鹏程.基于FPGA的数字视频帧频提升技术[D].重庆大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[46]马姚,林鑫,许怀哲.电磁场调制下石墨烯中Hartman效应的研究[J].材料导报,2013,10:157-160+164.
[47]胡剑波.关于非线性时滞系统的鲁棒稳定性条件的讨论[J].自动化学报,2000,06:853-854.
[48]邱佳慧,陶成,刘留,谈振辉.2.35GHz高速铁路宽带无线信道时间色散分析[J].铁道学报,2014,08:38-43.
[49]廖明清.对高硫采场60℃以下炮孔中炸药自爆危险性的探讨[J].有色金属(矿山部分).1992(02)
[50]翟川.柔性软件平台设计[D].四川大学,2004.