肠道病毒71型感染对小鼠CPT2、PSGL-1和SCARB2的表达和作用的影响

肠道病毒71型感染对小鼠CPT2、PSGL-1和SCARB2的表达和作用的影响

作者:师大云端图书馆 时间:2015-05-25 分类:期刊论文 喜欢:2368
师大云端图书馆

【摘要】第一部分肠道病毒71型感染对小鼠大脑与脑干肉碱棕榈酰基转移酶2表达和作用的影响目的:肉碱棕榈酰基转移酶(Carnitinepalmitoyltransferase,CPT)系统在长链脂肪酸β-氧化中起着重要作用,也是线粒体脂肪酸氧化产生ATP的关键组成部分。长链脂肪酸进入线粒体的限速步骤是在线粒体外膜CPT1的催化作用下,通过转脂作用把脂肪酰辅酶A转变成酰基肉碱,并且在CPT1的作用下进入线粒体基质;在线粒体内膜CPT2把酰基肉碱转换成酰基辅酶A,然后进入β-氧化途径。在本实验中我们研究肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)感染对小鼠大脑和脑干肉碱棕榈酰基转移酶2表达和作用的影响,探讨EV71相关脑炎的病理生理机制。方法:1日龄ICR小鼠8窝(48-80只),每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=107.5)的DMEM培养基O.1ml,观察小鼠感染后症状,并分别于病毒接种后5d、10d、15d各用乙醚安乐死6只感染组小鼠和6只0d(未接种病毒前)小鼠,取出大脑、脑干。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量;电子显微镜检测线粒体;应用免疫组织化学(Immunehistochemical,IHC)、Westblot、荧光定量RT-PCR法检测小鼠大脑、脑干CPT2的表达;检测大脑和脑干细胞的CPT2酶活性和ATP水平。结果:EV71感染小鼠后5天,在大脑检测到EV71RNA拷贝数为5.334±0.30log1ocopies/mgtissue,脑干为6.20±0.19log10copies/mgtissue;然而,随着感染时间延长,EV71RNA拷贝数逐渐降低。在感染后5天,电镜显示线粒体肿胀、线粒体嵴和线粒体膜断裂、变短或消失;CPT2表达下降,CPT2酶活性减低;ATP水平明显下降;而在感染后的10-15天,这些变化逐渐恢复到正常状态。结论:我们的研究资料显示:EV71感染损伤了脑组织的线粒体,引起CPT2的表达减少,导致CPT2酶活性降低、ATP生成减少。能量代谢障碍可能加速或加重了EV71脑炎发展,可能与脑炎的严重程度相关。本研究从能量代谢障碍方面阐述了EV71脑炎的病理生理机制。第二部分PSGL-1在肠道病毒71型感染小鼠的表达和作用目的:通过检测EV71感染小鼠不同组织中P选择素糖蛋白配体-1(MouseP-selectinglycoproteinligand-1,mPSGL-1)的表达,探讨P选择素糖蛋白配体-1(P-selectinglycoproteinligand-1,PSGL-1)在EV71感染中的作用。方法:1日龄ICR小鼠11窝(66-110只)随机分为2组,实验组8窝(48-80只)每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=107-5)的DMEM培养基0.1ml,另3窝(18-30只)为对照组,每只小鼠腹腔注射无菌DMEM培养基0.1ml。观察小鼠感染后症状,并分别于0d(接种病毒前)、病毒接种后、4d、8d、12d各用乙醚安乐死6只感染组小鼠与6只对照组小鼠,取出大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量;应用免疫组织化学、Westblot、荧光定量RT-PCR法检测小鼠大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏mPSGL-1的表达;应用免疫组织化学法检测CD4+、CD8+T淋巴细胞、巨噬细胞的表达;应用酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏的促炎细胞因子:肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfector-alfa,TNF-a)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-lbeta,IL-1β)含量。分析EV71感染小鼠不同组织的mPSGL-1的相对表达量对CD4+、CD8+、巨噬细胞表达的影响,以及与促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β产生水平的关系。结果:EV71感染小鼠中枢神经系统的病毒载量较心脏和肺脏的病毒载量增多;mPSGL-1在EV71感染小鼠的组织中表达增加,在感染后一定时间内,mPSGL-1在中枢神经系统的相对表达量比在心脏或/和肺脏的相对表达量明显增多,尤其在脑干和大脑增多更为明显。在所被测组织中的CD4+、CD8+、巨噬细胞免疫反应染色显示也增多;另外,在EV71感染小鼠所被测组织中的mPSGL-1相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β产生量有相关性:在感染后的4天,大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏的mPSGL-1相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β产生量成负相关;在感染后8天,除了心脏和肺脏的mPSGL-1相对表达量与TNF-a产生量未有相关性外,大脑、小脑、脑干、脊髓mPSGL-1的相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1β产生量仍成负相关;在感染后12天在所有被测组织未再有相关性。结论:在EV71感染时,局部组织的mPSGL-1表达增加,可能在白细胞募集与宿主的先天性固有免疫反应中起着重要作用。第三部分SCARB2在肠道病毒71型感染小鼠的表达与促炎细胞因子的关系目的:在感染性疾病时,清道夫受体(ScavengerreceptorclassB,member2,SCARB2)参与早期的先天性固有免疫反应;因此,本研究探讨肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)感染小鼠时,小鼠清道夫受体(mouseSCARB2,mSCARB2)在不同组织的表达和作用。方法:1日龄ICR小鼠13窝(78-130只)随机分为2组,感染组10窝(60-100只)每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=107.5)的DMEM培养基0.1ml,另3窝(18-30)只为对照组,每只小鼠腹腔注射无菌DMEM培养基0.1ml。观察小鼠感染后症状,并分别于病毒接种后2d、4d、6d、8d、12d各用乙醚安乐死6只感染组与对照组小鼠,取出大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量;应用免疫组织化学、Westblot、荧光定量RT-PCR法检测小鼠大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏SCARB2的表达;应用酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测小鼠大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏的促炎细胞因子:肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfector-alfa,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-lbeta,IL-1β)含量。分析EV71感染小鼠不同组织的SCARB2相对表达量与细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量的关系。结果:在EV71感染小鼠中枢神经系统的病毒载量较心脏和肺脏的病毒载量增多。在感染后一定时间段内,SCARB2在中枢神经系统的相对表达量较心脏或/和肺脏的相对表达量明显升高,尤其在脑干和大脑。另外,在EV71感染小鼠的不同组织的TNF-α、IL-6和IL-1p产生量与SCARB2相对表达量有相关性:在感染后4天、8天,大脑、小脑、脑干、脊髓、心脏、肺脏SCARB2的相对表达量与TNF-α、IL-6和IL-1p含量成正相关,感染后12天未再有相关性。结论:在EV71感染时,小鼠局部组织的SCARB2表达增加,可能在调节促炎细胞因子的产生中起着重要作用,尤其在中枢神经系统。
【作者】李继安;
【导师】陈宗波;
【作者基本信息】青岛大学,儿科学,2014,博士
【关键词】EV71感染;小鼠;肉毒碱棕榈酰基转移酶2;线粒体;ATP;白细胞;P选择素糖蛋白配体-1;促炎细胞因子;清道夫受体B2;促炎性细胞因子;

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