根结线虫DNA条形码标记筛选及在进境检疫性线虫中适用性分析

【摘要】植物寄生线虫是一种广泛危害农作物的重要病原物,而植物检疫性线虫的入侵不仅会危及生态系统的稳定性,且对农业生产安全和农产品进出口贸易造成严重威胁。线虫种类的准确鉴定在检疫中地位很重要,而传统形态学鉴定方法具有一定局限性,因此,具有快速、准确、标准化特点的DNA条形码技术受到日益关注,这种方法可利用特定分子标记的序列差异鉴定物种,并可建立数据共享的全球通用分类鉴定工具与平台。本文筛选了GenBank中根结线虫属(Meloidogyne)核糖体DNA(rDNA)的四个不同分子片段的序列,利用遗传距离法和系统进化学方法评价其作为根结线虫DNA条形码标记的可行性。结果显示:28S(D2/D3)、18S、ITS和IGS2的核酸序列种内平均遗传距离分别为0.0043、0.0027、0.024和0.0014,种间平均遗传距离分别为0.074、0.036、0.156和0.588。由于属内近缘种的影响,各分子标记的种内、种间遗传距离均有一定的重叠；基于K2P模型构建的NJ(Neighbour-Joining)系统发育树显示,28S(D2/D3)区具有相对较高的物种识别率,且有一定的遗传距离间隔,可以作为根结属线虫候选DNA条形码标记。对根结线虫属6个种26个群体的线粒体DNACOI片段和19个群体的核糖体DNA28S(D2/D3)片段进行扩增和测序,尝试验证其作为DNA条形码在根结属线虫中的应用可行性。结果表明,COI序列的种内、种间遗传变异之间存在较高重叠,其适用性需进一步探究：而28S(D2/D3)序列的种内、种间遗传变异之间存在部分重叠,但存在一定的遗传距离间隔。聚类分析显示除南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)这三个近缘种之间难以有效鉴别外,对于根结属线虫大多数种类均能有效区分。由于28S(D2/D3)分子片段的长度合适,扩增和测序成功率高,物种区分能力良好,种内遗传变异明显小于种间遗传变异,因此可作为根结属线虫DNA条形码研究的理想标记。初步评估基于GenBank的28S(D2/D3)序列作为我国进境检疫性线虫DNA条形码标记的适用性,结果显示：来自15个属56种植物检疫线虫的序列种内遗传距离与属内种间遗传距离变异之间存在小部分的重叠,但种内遗传距离94.8%小于0.02、种间遗传距离95.6%大于0.02,具有一定的”Barcodinggap”司隔区,构建的NJ系统发育树显示,56种植物检疫线虫按照所属分类阶元,以较高支持率分化成小杆目、矛线目、三矛目三个独立分支,且大部分线虫同一物种的个体都以较高支持率形成单系,只有少数近缘物种聚类在同一进化小分支难以有效区分。综合分析推断出28S(D2/D3)基因序列能有效地对植物检疫性线虫进行物种识别,可作为DNA条形码的理想候选标记。
【作者】林宇；
【导师】李红梅；
【作者基本信息】南京农业大学，植物病理学，2013，硕士
【关键词】DNA条形码；物种鉴定；植物检疫性线虫；根结线虫；线粒体DNA；COI；核糖体DNA；28S(D2/D3)；系统发育；

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