川续断皂苷Ⅵ治疗非酒精性脂肪性肝炎及其机制研究

【摘要】目的：探讨川续断皂苷VI对非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的防治作用及其作用机制。方法：应用ob/ob雄性小鼠建立非酒精性脂肪性肝炎模型，36只ob/ob小鼠，随机分成模型组和川续断皂苷VI低、中、高剂量组，正常组小鼠用C57BL/6J雄性小鼠代替（每组9只）。正常组喂食基础饲料，模型组和各治疗组喂食高脂饲料，喂食高脂饲料的同时开始给药，川续断皂苷VI各剂量治疗组分别按30、60、120mg/kgd腹腔注射给药，正常组和模型组分别腹腔注射等量生理盐水，连续给药4周后取材；称量各组小鼠体重，肝组织湿重，计算各组肝指数；制备肝线粒体和组织匀浆，检测肝线粒体膜电位变化和线粒体ROS含量；进行血脂和肝功能检测；采用HE染色法观察肝组织病理学改变，电镜法观察肝组织细胞超微结构变化；采用硫代巴比妥酸（TBA）法检测肝组织丙二醛（MDA）含量；比色法检测肝组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性；Westernblot检测P-JNK、Bax、Bcl-2、CytochromeC蛋白表达情况。采用棕榈酸（PA）诱导大鼠BRL细胞建立非酒精性脂肪性肝炎体外模型，根据实验要求设置对照组、PA处理组、川续断皂苷VI低、中、高浓度预保护组。采用MTT法检测PA对BRL细胞活性的影响；Bodipy493/503染色法检测BRL细胞内脂质沉积；DAPI染色法检测细胞凋亡形态学变化；AnnexinV-FITC流式细胞术检测细胞凋亡率；Westernblot检测P-JNK、Bax、Bcl-2蛋白的表达情况。结果：1、动物实验结果：（1）与正常组相比，模型组小鼠体重和肝指数明显增加（P<0.05），与模型组相比，川续断皂苷VI各剂量组体重、肝指数均有所降低，其中高剂量组存在统计学差异（P<0.05）；（2）与正常组相比，模型组小鼠肝功能（ALT、AST）受损严重，组织病理学显示肝小叶结构排列紊乱，肝细胞出现不同程度的脂肪变性，细胞体积明显变大，细胞核被挤在边缘，细胞质内存在大量脂肪空泡，形态与脂肪细胞类似，伴有不同程度的细胞碎屑样坏死和炎细胞浸润，部分肝组织出现轻、中度炎症及凋亡小体形成等病理改变，出现NASH病理特征，血脂（TC、TG、LDL-C）及肝组织氧化应激指标（MDA）均明显升高（P均<0.05），血脂HDL-C以及肝组织GSH-PX、SOD的活性均明显降低（P均<0.05）；川续断皂苷VI高剂量组与模型组相比，血清ALT、AST水平和肝组织脂肪变性、炎症程度均显著下降，血清TC、TG、LDL-C和肝组织MDA含量明显降低（P均<0.05）HDL-C及GSH-PX、SOD的活性增加（P均<0.05）；（3）模型组小鼠肝线粒体膜电位降低、ROS含量升高，与正常组相比有显著性差异（P<0.05）；川续断皂苷VI处理组线粒体膜电位升高、ROS含量降低，和模型组相比有显著性差异（P<0.05），并呈现剂量依赖性；（4）与正常组小鼠相比，模型P-JNK、Bax和CytochromeC蛋白表达增强，Bcl-2蛋白表达水平下降（P<0.05）；川续断皂苷VI各剂量组P-JNK、CytochromeC和Bax蛋白表达较模型组相比降低，Bcl-2蛋白表达水平增强，其中川续断皂苷VI高剂量组具有统计学意义（P<0.05）。2、细胞实验结果：（1）不同浓度（50、100、150、200μmol/L）的PA作用于BRL细胞24h和48h后，细胞存活率较对照组均有下降，当细胞浓度为大于150μmol/L作用细胞48h存活率低于50%，因此，为了降低PA对肝细胞的毒性，在后续实验中，我们选用48hIC50浓度（150μmol/L）作为PA最佳诱导浓度（2）PA诱导的BRL细胞48h，细胞内脂质沉积明显，川续断皂苷VI高浓度组可有效抑制脂质沉积（P<0.05）。（3）PA诱导的BRL细胞48h，与对照组相比，细胞凋亡明显增加（P<0.05）、凋亡细胞发生形态变化；与PA组相比，川续断皂苷VI各浓度组可有效抑制肝细胞凋亡的发生。（4）PA诱导的BRL细胞P-JNK、Bax蛋白表达量明显增加，Bcl-2蛋白表达量显著减少（P<0.05）；与PA组相比，川续断皂苷VI各浓度组可不同程度抑制P-JNK、Bax蛋白的表达，促进Bcl-2蛋白表达，有效抑制肝细胞凋亡的发生，中、高浓度组差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：1.本实验成功制备与人体NASH病理特点比拟的实验性小鼠模型，以及NASH体外模型，为NASH发病机制及药物等干预性研究提供了较好实验模型。2.川续断皂苷VI可能通过抑制ob/ob小鼠体内氧化应激、抑制肝细胞凋亡，发挥肝功能保护作用。3.川续断皂苷VI可能通过缓解棕榈酸诱导肝细胞脂毒性，减少肝细胞内脂质沉积，抑制细胞凋亡，发挥肝细胞保护作用。4．川续断皂苷VI治疗NASH作用机制可能与其通过抑制JNK蛋白磷酸化，从而抑制促凋亡蛋白Bax表达、促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制线粒体细胞色素C的释放，最终阻断线粒体凋亡通路有关，但其具体机制仍需进一步深入研究。
【作者】李广润；
【导师】刘丽宏；
【作者基本信息】苏州大学，药理学，2014，硕士
【关键词】非酒精性脂肪性肝炎；川续断皂苷Ⅵ；凋亡；棕榈酸；BRL细胞；

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