φC31整合酶及HIV整合酶的结构、功能初步解析

【摘要】基因治疗和转基因研究中,利用定点整合酶有效地将目的基因位点特异性地整合到细胞基因组中,可以使目的基因获得安全和长期的表达。ΦC31整合酶作为一个来源于链霉菌噬菌体的位点特异性整合酶,近年来它被广泛应用于基因治疗和转基因研究中,但是和病毒载体相比,它存在一个效率较低的问题。来源于HIV的慢病毒载体系统为目前最广泛使用的整合性病毒基因载体,但是HIV整合酶介导的随机整合构成其基因治疗应用安全性隐患。开发具备HIV整合酶整合效率和ΦC31整合酶定点整合特点的转基因体系,对基因治疗研究有重大意义。本研究的基本目的是解析ΦC31整合酶特异性DNA识别结合能力的基础,并探讨细胞内蛋白质对HIV整合酶介导转基因效率和基因表达的影响从而为研究整合酶的结构功能关系以及细胞蛋白对整合酶功能的影响,以及进一步设计和开发上述体系提供所必需的前期理论基础。本文首先研究了ΦC31整合酶C端的DNA结合功能域。酵母双杂交的方法筛选到11个和ΦC31整合酶有相互作用的细胞蛋白,其中DAXX通过结合ΦC31整合酶的451RFGK454抑制其活性。在此基础上,我们研究了这些氨基酸对ΦC31整合酶活性的影响及影响机制。首先,在大肠杆菌中通过蓝白斑方法检测整合酶活性,结果表明：去除了451RFGK454的突变体活性下降非常明显,只有野生型的4.52%+3.56%,而突变体R451H也只保留了42.03%±7.08%的活性,说明451RFGK454是ΦC31整合酶活性所必需的氨基酸。神经网络方法、最近邻居法以及卷曲螺旋分析提示氨基酸407-517的二级结构符合Helix-Turn-Helix特征,可能为DNA结合基序。EMSA实验表明：451RFGK454去除或第451位精氨酸突变成组氨酸后,ΦC31整合酶的DNA结合能力以及结合的特异性都大大下降,说明这四个氨基酸是影响整合酶对其底物特异性识别和结合的关键氨基酸。但是预测的DNA结合基序407-517却没有DNA结合能力,去除这个基序的ΦC31整合酶也没有结合能力。可能原因是表达的407-517基序它没有很好地折叠成HTH的结构,圆二色谱方法证实了这一点,另一个原因可能是ΦC31整合酶本身结构和功能的复杂性造成的,它并非简单地由某个单一的结构域来完成某项功能,一个功能的完成也可能不仅依赖于某个特定结构域,整个酶的各个结构域之间不是独立的,而是互相协作的,407-517基序可能确实是负责特异性结合DNA的主要功能域,但是它单独起作用无法完成识别和结合DNA这个过程,需要其它结构域的协助。接下来我们研究了细胞内能够和HIV-1整合酶发生相互作用,抑制或促进慢病毒基因组整合和基因表达的蛋白。最初发现过转SUM01/Ubc9、SUM02/Ubc9能改变HIV-1IN在细胞内的定位,由均匀弥散分布变为细胞核内的颗粒状分布,HIV-1IN可能被定位到了内源的PML核体上,HIV-1IN和PML的亚细胞定位实验显示两者具有强烈的共定位,因此推想：过转的SUMO1/Ubc9或SUMO2/Ubc9可能起到一个桥梁的作用,它们能和HIV-1IN发生相互作用并把它带到内源的PML核体上。基于这个推测,我们进行了酵母配对实验、亚细胞定位实验和免疫共沉淀分析,证明HIV-1IN能和SUMO1、SUMO2、Ubc9发生直接相互作用,和PML之间发生间接作用。进一步的实验证明HIV-1IN能够被SUMO1、SUMO2所共价修饰。最后我们考察了这些蛋白对慢病毒基因组的整合以及报告基因EGFP表达的影响。通过流式细胞仪检测病毒感染后EGFP阳性细胞率来较粗略地表征慢病毒基因组的整合情况,结果发现：单独过转Ubc9时,EGFP阳性率由载体对照组的37.29%±7.54%下降到了25.21%±2.63%(p<0.05),而Ubc9和SUMO1同时过转时,下降更明显,阳性率为16.46+3.02%(p<0.01),有极其显著性差异,Ubc9和SUM02同时过转时阳性率变为22.89%±4.49%(p<0.05)。Ubc9可以极大地抑制慢病毒基因组的整合,并且SUMO1和SUM02存在时抑制作用加强,存在加和作用。此外,我们还采用了Alu-LTRReal-TimeNestedPCR的方法检测慢病毒整合,结果和前一种方法吻合。最后我们检测了报告基因EGFP的平均荧光强度变化,结果和对照组相比,平均荧光强度都下降到了80%左右,引起这种平均荧光强度变化的因素是Ubc9,SUMO1或SUM02存在时没有加和作用。尽管本实验证明PML蛋白对慢病毒感染并没有抑制作用,但是PML-NB里的几个主要组成型蛋白如sp100、DAXX等都对慢病毒感染具有不同程度的抑制作用,这几个蛋白能够被SUMO化共价修饰或和SUMO有非共价相互作用,且都能够和HIV-1IN发生直接的相互作用,结合本实验的结果,我们提出了一个SUMO通路介导的PML-NBs抑制慢病毒感染的模型：HIV-1IN和Ubc9、SUMO直接结合,Ubc9是介导SUMO偶联到它们底物上的关键酶,PML-NBs是一个高度SUMO化的结构,结合了IN的Ubc9-SUMO复合体通过和定位在PML-NB上的E3连接酶的相互作用,将SUMO偶联到它的底物如sp100、Daxx上,因此通过SUMO通路,HIV-1IN被捕获到PML-NB上,另一方面,HIV-1IN自身能够被SUMO1、SUMO2所共价修饰,SUMO化后的IN也能够定位到PML核体上。核体里的蛋白如sp100、DAXX等和IN发生直接相互作用,进入下游信号通路,最终抑制慢病毒基因组的整合或基因表达,综上所述,本文初步解析了ΦC31整合酶C端的DNA结合功能域,找到了影响特异性DNA识别和结合的4个关键氨基酸,为利用ΦC31整合酶定点整合特点改造随机整合的病毒整合酶(如HIV整合酶)提供了结构方面的信息和基础。另一方面,研究了胞内SUMO通路蛋白对HIV整合酶介导的转基因效率和基因表达的影响,为改造慢病毒载体系统进一步提高其转基因效率提供了前期理论基础。
【作者】李智慧；
【导师】薛京伦；陈金中；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2009，博士
【关键词】ΦC31整合酶；DNA结合基序；HIV-1整合酶；PML核体；慢病毒；SUMO；

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