生物质谱分析的若干微纳新技术研究

【摘要】本博士学位论文的主要贡献在于：1.针对基于质谱的蛋白质组学研究中存在的三个问题：液质联用技术对复杂蛋白的肽段进行分析时存在漏检;液相色谱分离蛋白后无法实现在线快速酶解质谱分析；低丰度的蛋白或者肽段缺乏高效的富集手段,创造性的结合微液滴操控以及生物质谱,成功的在一定程度上解决了复杂样品液质联用分析时漏检的问题,实现了蛋白质在液相色谱分离后快速酶解以及高效的浓缩富集。2.针对临床上对治疗药物快速检测的需求,提供了一种使用泡沫石墨烯纸结合质谱进行纸喷雾的技术手段,并且成功的用于唾液中苯丙胺的检测,为临床实验室进行药物检测以及个性化治疗方案的制定提供了可靠的参考。3.针对商业质谱离子源存在的一些缺陷,提出了相应的改进措施,同时对于样品的无损快速分析以及高通量检测提供了一些新的技术手段。过去的二十年,是蛋白质组学飞速发展的二十年,自1995年MarcWilkins首次提出蛋白质组的概念,到2001年美国成立了国际人类蛋白质组学研究组织,随后在欧洲,亚太地区都成立了区域性蛋白质组学研究组织,融合各方面的力量推进蛋白质组学向前发展。蛋白质组学的研究很大程度上依赖技术的进展,其中生物质谱已经成为蛋白质组学研究的主要技术手段。解决生物质谱在蛋白质组学研究中存在的问题,最大限度的发挥其优势,对于推动蛋白质组学的发展非常重要。首先,基于肽段的研究是蛋白质组学两大技术路线之一,将复杂样品的蛋白质利用蛋白酶酶解成肽段,然后利用液相色谱分离质谱定性已经成为一种常规的技术手段。对于复杂的样品,很多肽段在液相色谱流出时共出峰,质谱由于扫描速度的限制没有办法对全部的流出物都进行扫描鉴定,因而导致一部分共流出肽段漏检,相关信息有所流失。常规的解决办法是通过预处理手段尽可能的简化样品来降低肽段共流出的可能性,以及多次重复进样分析以增加共流出肽段检出的可能性。从分析的角度讲,上述方法都存在一定的问题。预处理样品,操作繁琐,在操作的过程中容易造成样品损失,同时容易引入污染；多次重复进样分析,既浪费样品又增加了分析时间,尤其当样品量比较少且较珍贵时,则更是行不通。其次,基于蛋白的研究是蛋白质组学研究的另外一条主要的技术路线,将样品中的混合蛋白先使用液相色谱分离,收集其馏分,再进行蛋白质的酶解以及相关的质谱分析。对于复杂的样品,先分离蛋白在酶解成肽段有利用降低样本的复杂程度,对于后续的分析鉴定有很大的帮助,但是也存在着一定的问题。常规的方法所需要的时间很长,而且由于不是在线分析,引入了中间步骤,有可能造成样品损失以及引入污染,因而迫切的需要一种能够实现液相色谱分离蛋白,快速酶解并且可以在线的进行质谱检测的装置以及方法。再次,在蛋白质组学的研究中,由于蛋白质的丰度千差万别,对于低丰度蛋白或者肽段的鉴定一直都是个难题。针对这个问题,有多种方法用来富集浓缩样品,尤其是近年来很多实验室开发了各种各样的材料来特异性的富集某一种或者一类的肽段,但是其富集效率和选择性一直都存在问题。在富集的过程中由于选择性的问题,容易引入其他的蛋白,影响目标低丰度蛋白的鉴定；同时由于是离线操作,过程中引入的许多影响因素导致了最终鉴定结果的不理想,因而亟待提出一种普适的能够在线使用的快速高效浓缩富集方法。质谱由于其对化合物准确的定性和定量分析的性能,已经广泛的用于临床进行相关的分析。治疗药物的监测在临床上是非常重要的部分,通过实时的药物监测可以指导合理用药,对于提高药物疗效,减少或者避免毒性反应的发生具有重要的意义。传统的方法,样品的处理时间长,操作繁琐,容易引入其他污染,造成结果的偏差,因而亟需开发新的无需样品处理又能够快速准确的对治疗药物进行实时监测的技术手段。质谱的离子源以及样品的引入方式有很多种,现在商用的离子源由于其普适性的原因,在对一些样品的检测分析时则存在一定的缺陷,例如光离子化源的寿命短,电喷雾离子源的离子化效率不高等；同时在质谱与其他仪器联用和快速扫描分析上存在进样方法单一,分析时间较长等问题。这些缺陷亟待开发新的技术方法予以补充,进一步完善其功能,更好更快地完成对样品的分析检测工作。针对质谱在上述蛋白质组学,临床药物监测,离子源及接口技术所面临的问题,本博士论文分为六章开展研究工作。各章节的主要内容如下：第一章是绪论部分。本章主要讨论了质谱在其重要应用领域中的发展现状以及与质谱相关的联用技术在这些领域的应用进展,从而引出了本论文工作的研究方向,为解决质谱及与其相关的联用技术在上述应用领域中存在的问题进行相关的新方法与新技术研究提供理论依据与实际意义。第二章主要介绍了使用液滴隔断液相色谱,离线质谱测定用于基于肽段的蛋白质组学的新方法研究。我们建立了使用全氟萘烷隔断液相色谱的馏分形成液滴并收集在毛细管中,在离线对油相隔断的液相色谱馏分进行质谱测定的体系。使用标准肽段混合物对整个体系进行了系统的评估,证明了其可行性。同时将这套系统应用于复杂的腾冲噬热菌蛋白质组的研究,一次分析得到的结果可以与常规系统六次分析的结果总和相媲美,在一定程度上解决了液质联用技术对于复杂样品分析时存在的漏检问题。第三章主要介绍了使用液滴在微流控芯片上实现了液相色谱分离蛋白后的快速酶解和在线质谱鉴定的新方法研究。我们通过液滴将蛋白酶与液相色谱馏分充分混合反应,实现蛋白质的快速高效酶解,建立了液相色谱-微流控酶解芯片-质谱的在线分离,酶解,鉴定的平台。该平台成功的应用于细胞色素C,肌红蛋白,溶菌酶蛋白混合物的在线分离酶解鉴定,为基于蛋白的蛋白质组学研究提供了一种新的技术手段。第四章主要介绍了使用液滴在微流控芯片上实现了液相色谱分离蛋白或者肽段后在线浓缩富集,质谱鉴定的新方法研究。我们通过使用与液相色谱馏分部分相溶的油相试剂与液相色谱馏分形成液滴,在微流控芯片的通道内流动的过程中水相不断的被油相吸收,使液滴内的样品快速浓缩,在线的与质谱进行联用分析,建立了液相色谱-微流控浓缩芯片-质谱的在线分离,富集,鉴定的平台。该平台成功的应用于对牛血清白蛋白酶解肽段提高覆盖率的研究中,为蛋白质组学中低丰度蛋白或者肽段的鉴定提供了一种新的技术手段。第五章主要介绍了使用泡沫石墨烯纸喷雾结合质谱的方法对治疗药物进行检测的新方法研究。我们将合成的泡沫石墨烯抽滤到色谱纸上,烘干后进行纸喷雾质谱实验。泡沫石墨烯的加入提高了色谱纸的导电性,增强了其憎水性,有利于样品检测信号的提高。与常规的色谱纸相比,泡沫石墨烯纸对样品的吸附性下降,对样品定性分析的信号强度提高至少十倍；同时在对药物定量分析方面,检测限与线性范围均有十倍以上的提高,为临床上进行药物监测以及个性化治疗方案的制定提供了一种可靠的技术手段。第六章主要介绍了对常规质谱离子源与接口技术的一些改进,以及实验室自主研发质谱的分析检测及验收情况,对质谱及与其相关的联用技术在样品分析中存在的问题提出了解决方案,完善了其性能,有利于更好的完成目的性分析工作。
【作者】聂磊；
【导师】杨芃原；
【作者基本信息】复旦大学，化学生物学，2013，博士
【关键词】蛋白质组学；液质联用技术；微流控芯片；液滴；在线酶解；在线富集浓缩；纸喷雾；临床药物监测；离子源；质谱接口技术；快速检测分析；

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