腮腺素基因串联表达载体的构建及其蛋白表达

【摘要】水从舌边是为活字，意为舌旁之水(即唾液)能维持人体的生命活力。唾液是口腔内唾液腺所分泌的混合物，是无色、无味的近于中性的泡沫状液体。其成分与血浆类似，绝大部分是水，除此之外是各种盐离子、酶类、免疫球蛋白、神经生长因子等，还包括一种内分泌的蛋白类激素——腮腺素(Parotin)。腮腺素主要由腮腺、颌下腺分泌。腮腺和颌下腺分泌的唾液在流入口腔之前，在腺体排出管的“条纹部”流动较缓，唾液内具有内分泌作用的腮腺素在此处得到吸收。人20多岁，唾液腺开始渐渐脂肪性萎缩，分泌量逐渐减小。随着年龄的增加，症状逐渐加重，等到60多岁，腮腺组织会减少至原来的60%。人进入成熟期后，相比颌下腺、舌下腺，腮腺的腺泡明显较早萎缩，被脂肪取代。腺体条纹部的结构不断变化，使得腮腺素在条纹部的吸收作用减少。腮腺素缺乏会导致间叶组织供养障碍引起假老化的现象，这是继发性老化并非真的老化，是从初老期开始逐渐加重的老年病态改变。假老化会引起软骨软化，骨质疏松症，牙槽脓漏等问题。软骨软化，是变形性关节炎或脊椎病的病因之一；骨质疏松症则骨皮质薄、脆而骨小梁稀松，如果在发育期缺乏腮腺素，会有短肢症的倾向；牙槽脓漏体现为牙周组织改变，齿龈边缘有严重的炎症侵润。腮腺素对由腮腺素缺乏而引起的间叶组织营养障碍性疾病(假老化)具有很好疗效。腮腺素是一种蛋白类激素，在唾液中的含量极低，分离提取难度很大；化学合成腮腺素，其氨基酸可能会消旋，并且成本比较高，不适合大量生产。基因工程的方法是现代生物科学获得目的蛋白的重要手段之一。由于腮腺素蛋白分子量低，采用常规基因工程方法构建单拷贝基因重组载体进行表达，表达量很低而且不稳定，所以本实验采取基因串联技术将腮腺素基因首尾定向相连，增加其拷贝数，使得表达量和稳定性都大大提高。本研究采用SOE-PCR的方法获得腮腺素基因的全长，即在上下游引物的5’端分别添加同尾酶XhoⅠ，SalⅠ的识别位点，以及溴化氰和羟胺的裂解位点，并利用同尾酶法对基因有目的地进行操作，使其首尾相连，在克隆载体中逐步构建出含有9个基因拷贝数的串联体。选择pET32a作为表达载体，腮腺素基因串联体与各个标签共同表达，其蛋白分子量约为35KD。通过SDS-PAGE检测到了目的蛋白的存在，然后利用His-Tag抗体进行WesternBlot鉴定。对表达条件进行优化，在37℃，IPTG浓度为0.5mM，诱导表达3小时，提取菌体总蛋白，然后通过NiSepharose纯化得到串联的腮腺素蛋白，为后续获得腮腺素单体蛋白的纯品奠定了研究基础。
【作者】林雪贞；
【导师】张桂荣；施维；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】腮腺素；串联；原核表达；蛋白纯化；

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