基于CMV启动子拯救新城疫病毒La Sota疫苗株质粒系统的构建
【摘要】新城疫（Newcastledisease，ND）是禽副黏病毒9种血清型中的血清Ⅰ型禽副黏病毒（即新城疫病毒，NDV）引起的鸡和火鸡等多种禽类急性高度接触性传染病，常呈败血症经过。新城疫为禽类高致病性病毒性疾病之一，因其发病率和死亡率都很高，给养禽业带来的经济损失尤为显著，在以农业为国家主要收入来源的第三世界国家中广泛流行。新城疫病毒为单股不分节段负链RNA病毒，是副黏病毒科的重要成员和模型病毒。NDV基因组RNA是负链，本身不具有感染性，不带译制病毒蛋白质的信息，不能用作模板开始感染周期，只有与核蛋白NP等结合成核糖核蛋白复合物RNP，才能作为模板启动复制和转录。近几年，因为NDV潜在的致病力，溶瘤作用以及可作为人类和动物疫苗载体等特点，对于新城疫的研究越来越受到国内外同行们的高度重视。因其转录过程由RNA到RNA，复制时不存在DNA阶段，重组几率小，以NDV为基础的重组疫苗为弱毒活疫苗的研制提供了相关的选择。针对负链RNA病毒而言，其反向遗传操作过程是通过RT-PCR方法分段扩增，克隆在一个合适的载体，将病毒基因组RNA变成cDNA，首先构建得到病毒全长感染性cDNA克隆，然后与构建的辅助质粒共转染真核细胞，最终“拯救”出具有感染性的病毒粒子。反向遗传操作技术使得新城疫病毒基因组个别基因突变或基因同源替换等操作更加方便灵活。通过该技术使得在分子水平上研究RNA病毒基因组结构与功能的人工操作成为可能，为研究病毒致病机理，病毒与宿主相互作用提供了一种有效的方法，是RNA病毒基础研究的重要技术工具。利用反向遗传操作技术获得的重组病毒广泛应用于活病毒载体疫苗的研制、外源基因的表达、分子标记疫苗以及新型活疫苗的创制。运用现代分子生物学技术和高通量全基因组测序，使我们对新城疫病毒生物学特性的认知范围迅速扩大。新城疫病毒的拯救通常使用重组T7RNA聚合酶牛痘苗病毒（VV/T7）感染细胞，将由T7启动子控制的全基因组转录质粒与辅助质粒进行共转染，获得具有感染性的重组病毒。但是此方法需要利用携带T7RNA聚合酶的痘病毒载体提前感染细胞，细胞感染痘病毒后自身会产生细胞病变，这样很有可能导致外源病毒还没有被拯救，而细胞自身已经死亡，如此一来就增加了操作过程中的不确定性和复杂性。本实验以新城疫病毒LaSota疫苗株为模板，在CMV启动子下游、全长cDNA两端引入部分锤头核酶（hammerheadribozyme，HamRz)序列和δ肝炎病毒核酶（hepatitisdeltavirusribozyme，HdvRZ）序列，使细胞中RNA聚合酶II控制基因组转录，利用分子克隆的方法，新城疫病毒LaSota株全基因组被分成7个片段，分别克隆至pBluescriptIIKS+载体，经测序鉴定与基因组RNA对应序列完全一致后，利用相邻片段重叠区域的酶切位点，通过体外拼接组装成完整基因组cDNA，克隆至真核载体pCI-neo中，为建立高效拯救系统提供了必需的全长cDNA转录质粒。通过PCR方法扩增三个目的基因，构建辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L，并通过间接免疫荧光试验、RT-PCR等方法进行鉴定。最终建立了在CMV启动子控制下，依赖RNA聚合酶II的、操作简便的新城疫病毒LaSota株全长转录质粒及辅助质粒，为新城疫病毒反向遗传操作平台的建立奠定了基础。
【作者】李想；
【导师】丁壮；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】新城疫病毒（NDV）；反向遗传；CMV启动子；质粒系统；
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