慢病毒介导的shRNA干扰IRG1基因表达及其在布鲁菌感染中的作用

【摘要】布鲁菌病是一种由布鲁菌侵染动物机体后引发的人畜共患传染病。该病主要危害被感染动物的生殖系统及淋巴系统，在临床上主要表现为流产、生殖器官及胎膜发炎等症状。该病在全世界广为流传，危害极大，其疫情在地理分布上呈逐年扩散趋势，发病率在世界范围内呈上升趋势，其传播流行不仅使畜牧生产损失严重，且对人类身体健康危害甚重。因此，对布鲁菌病的防制不仅具有兽医学意义，而且具有重要的公共卫生学意义。在布鲁菌病防制方面，疫苗的研发一直是科研工作的热点。然而目前应用的疫苗均存在不同程度的缺陷而难以得到广泛应用，且新型疫苗的研发进展缓慢。本课题组在研究中发现布鲁菌体外感染巨噬细胞系RAW264.7后IRG1的表达升高。研究表明，布鲁菌的致病性与LPS有关，而IRG1受LPS的诱导调节，其表达又与巨噬细胞活化重要的细胞因子IFN-γ和TNF-ɑ相关。因此，本课题拟通过RNAi技术实现对IRG1基因在小鼠巨噬细胞系RAW264.7基因表达的沉默，验证IRG1基因沉默细胞株抗布鲁菌体外感染作用。因此，本实验首先扩增获得约2000bp的IRG1基因，经测序鉴定正确后连入双荧光素酶表达载体。然后针对IRG1基因的不同靶位设计了4个siRNA，利用脂质体共转染293T细胞，通过双荧光素酶检测发现siRNA1可使海肾荧光素表达水平显著降低，由此获得针对IRG1基因的最佳干扰序列。将shRNA1成功连入慢病毒表达载体，经酶切、测序鉴定正确后，以重组慢病毒转染293T细胞，在荧光显微镜下可见大量红色荧光；以包装所得慢病毒感染293T细胞在荧光显微镜下可见红色荧光，表明慢病毒包装成功。经嘌呤霉素杀细胞实验测得嘌呤霉素对293T细胞的最小致死浓度为2.5μg/mL；将浓缩后的病毒倍比稀释后感染293T细胞，测得病毒滴度可达108TU/mL。进一步研究发现5.0×104TU/mL的慢病毒对RAW264.7细胞的毒性最弱，而嘌呤霉素最佳筛选浓度为2.0μg/mL，以此浓度的慢病毒感染RAW264.7细胞后，加入2.0μg/mL的嘌呤霉素进行压力筛选，从而获得IRG1基因沉默的RAW264.7细胞系。进一步检测表明：稳定整合慢病毒基因的RAW264.7细胞在荧光显微镜下可见大量红色荧光；IRG1基因沉默对RAW264.7细胞的生长、形态无显著影响。通过Real-timePCR对构建的基因沉默细胞系IRG1基因的抑制效果进行检测表明，基因沉默细胞的基因抑制率可达92.73%。荧光定量PCR结果显示，基因沉默细胞组用16M和M5布鲁菌处理后，其IRG1的mRNA水平分别升高了8倍和11.5倍，与对照相比差异极显著。布鲁菌侵染细胞实验表明，与对照组相比，无论是LPS诱导的IRG1基因上调细胞还是RNAi所致的IRG1基因表达抑制细胞，其布鲁菌感染复数均差异不显著。以上研究结果表明，用双荧光素酶检测系统可成功筛选出能使IRG1基因mRNA水平显著降低的siRNA；将此siRNA连入慢病毒载体表达质粒后能包装出使RAW264.7细胞IRG1基因沉默的慢病毒；IRG1基因沉默不能对布鲁菌感染复数（MOI）产生显著影响；16M和M5布鲁菌对IRG1基因沉默细胞的IRG1mRNA水平影响有差异，且与对照组相比差异极显著。本研究为IRG1基因及相关调控基因抗布鲁菌病作用研究提供了理论基础和实验依据。
【作者】孙良文；
【导师】韩文瑜；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】RAW264.7细胞；RNA干扰；IRG1基因；布鲁菌；

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