Syntenin在乳腺癌中的生物学功能及其机制研究

【摘要】第一部分Syntenin在乳腺癌细胞系和组织中的表达情况及稳定细胞株的构建目的：检测syntenin在乳腺癌细胞系及27对癌-癌旁组织中mRNA和蛋白的表达情况。构建稳定高表达syntenin的乳腺癌细胞系和稳定敲除syntenin的乳腺癌细胞系,为研究syntenin在乳腺癌中的生物学功能提供稳定实验细胞株。方法：(1)采用Trizol试剂提取细胞及组织的mRNA,反转录成cDNA后,以实时定量PCR检测相关蛋白mRNA水平；(2)WesternBlot检测细胞及组织蛋白表达水平；(3)从正常人cDNA文库中扩增出syntenin全长,构建过表达病毒质粒,293T细胞包装病毒后感染MDA-MB-231细胞,嘌呤霉素筛选后得到稳定表达细胞系；(4)构建syntenin干扰表达质粒,293T细胞包装病毒后感染MDA-MB-231HM细胞,嘌呤霉素筛选后得到稳定细胞系；(5)实时定量PCR及WesternBlot检验稳定表达细胞系的过表达或干扰效果。结果：(1)SynteninmRNA和蛋白水平在乳腺癌高转移细胞株MDA-MB-231HM中高表达；(2)SynteninmRNA和蛋白水平在乳腺癌组织中高表达；(3)成功构建syntenin稳定高表达细胞株231-SYN,其细胞中mRNA和蛋白水平明显高于对照细胞；(4)成功构建syntenin稳定干扰表达细胞株231HM-262和231HM-622,其细胞中mRNA和蛋白水平明显低于对照细胞。结论：Syntenin在乳腺癌高转移细胞系和乳腺癌组织中高表达,说明syntenin参与了乳腺癌发生发展过程,可能在乳腺癌转移中起重要作用。成功构建syntenin稳定过表达和干扰细胞系,为在乳腺癌细胞系中研究其生物学功能提供了理想的实验细胞模型。第二部分Syntenin对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响及其相关机制研究目的：研究syntenin在体外对乳腺癌细胞细胞周期、生长增殖和迁移侵袭的影响,并初步探讨其作用机制。方法：(1)采用流式细胞技术研究syntenin对乳腺癌细胞周期的影响；(2)采用CCK8生长曲线研究syntenin对乳腺癌细胞体外增殖的影响；(3)应用划痕实验和Transwell迁移实验来研究syntenin对乳腺癌细胞迁移运动能力的影响；(4)运用Transwell侵袭实验研究syntenin对乳腺癌细胞体外侵袭运动能力的影响;(5)Westernblot研究syntenin对MAPK信号通路的影响；(6)采用Westernblot及Integrinβ1功能抑制抗体研究Integrinβ1在ERKMAPK信号通路激活中的作用；(7)采用ERK1/2特异型抑制剂U0126研究ERK1/2激活在syntenin过表达引起的乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用。结果：(1)流式细胞结果表明syntenin过表达或者敲除相对于对照组,其细胞周期中各个时期的比例没有变化；(2)CCK8增殖实验表明syntenin蛋白表达的改变对乳腺癌细胞增殖能力没有影响；(3)细胞划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,syntenin过表达细胞组相对于对照组,其体外迁移能力明显增强,相反,syntenin敲除细胞组相对于对照组,其体外迁移能力明显减弱；(4)Transwell侵袭实验表明syntenin过表达细胞,其体外侵袭能力显著增强,而敲除syntenin后,其体外侵袭能力显著降低；(5)Syntenin过表达引起ERK1/2的激活,但是对JNK和p38没有影响；(6)Syntenin过表达引起活性Integrinβ1的表达升高,且Integrinβ1的激活影响ERK1/2的激活；(7)与对照组相比,使用了ERK1/2抑制剂U0126预处理的稳定高表达细胞株231-SYN,其细胞迁移和侵袭能力明显被抑制。结论：Syntenin在体外对乳腺癌细胞周期和增殖能力没有影响,但是影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭。Integrinβ1和ERK1/2信号通路的激活在syntenin过表达引起的乳腺癌细胞迁移和侵袭中是必须的。第三部分Syntenin对裸鼠成瘤和转移的影响以及与临床参数的关系目的：研究syntenin表达在裸鼠模型中对裸鼠移植瘤生长和转移的影响及其在乳腺癌组织中的表达情况,阐明人乳腺癌组织中syntenin的表达与临床参数及预后的关系。方法：(1)建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型,从体内角度研究syntenin表达对乳腺癌侵袭转移的影响；(2)采用HE染色观察肺转移情况；(3)采用1HC方法标记移植瘤内新生血管(CD31),计数微血管密度(microvesseldensity,MVD)；(4)采用IHC方法在239例人乳腺癌组织标本中研究syntenin的表达情况；(5)对syntenin在乳腺癌组织中的表达情况,分两种类型统计,分别是syntenin阳性表达和syntenin阴性表达,采用Spearman’s相关分析研究其与乳腺癌临床指标的关系；(6)采用Kaplan-Meier生存分析研究syntenin的表达与患者无病生存率及总生存率的关系。(7)采用Cox比例风险回归分析研究syntenin是否是一个影响浸润性乳腺癌患者总生存率和无病生存的独立预后因素。结果：(1)Syntenin过表达能促进裸鼠移植瘤的生长而syntenin下调可以抑制裸鼠移植瘤的生长；(2)Syntenin过表达能促进裸鼠移植瘤的肺转移,相反syntenin干扰表达能抑制裸鼠肺转移的形成；(3)Syntenin过表达的裸鼠移植瘤中微血管密度明显高于对照组,而syntenin下调表达形成的裸鼠移植瘤中,其微血管密度相对于对照组明显降低；(4)对乳腺癌组织的IHC研究结果显示,在239例乳腺癌患者中,有88例患者为syntenin阳性表达,阳性表达的比例为36.82%,syntenin阳性表达与肿瘤大小、淋巴结转移情况和转移复发相关联；(5)Syntenin阳性表达患者的总生存率和无病生存率较低；(6)多因素分析结果显示,Syntenin是影响浸润性乳腺癌患者总生存率和无病生存的一个独立预后因素。结论：Syntenin的表达可以促进乳腺癌肿瘤的生长、肺转移状态和微血管形成；Syntenin状态是乳腺癌患者一个潜在的预后指标。
【作者】杨彧；
【导师】邵志敏；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学与分子生物学，2013，博士
【关键词】乳腺癌；syntenin；过表达；干扰；迁移；侵袭；ERK1/2；肿瘤转移；预后；

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