表皮生长因子受体变异体促进上皮性卵巢癌侵袭及顺铂耐药的研究

【摘要】卵巢癌是导致女性癌症患者死亡的第五大原因,但仍位居妇科肿瘤中患者致死的第一位。在过去的25年中,虽然其生存率有所改善,卵巢癌患者的5年生存率仍低于50%。卵巢癌之所以预后不良,是因为晚期患者发生广泛转移和产生化疗耐药。卵巢癌主要分为三种类型,上皮细胞型、基质细胞型和生殖细胞型。其中多数的卵巢癌属于上皮性卵巢癌。表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜糖蛋白,属于受体酪氨酸激酶生长因子受体家族,参与重要的生理过程,如细胞的存活、增殖和运动。在众多人类肿瘤中,EGFR的过度表达都已被证实与肿瘤晚期和患者预后不佳具有密切相关性,如乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌和卵巢癌。在人类肿瘤中EGFR的编码序列经常会出现改变。其胞外结构域大部分的缺失的突变与患者预后不佳存在相关性。通常这些突变体能持续激活并使肿瘤细胞具有更强的生长能力,以及增加其恶性潜能。最近,de4EGFR,一种表皮生长因子受体(EGFR)第4外显子缺失的变异体在胶质母细胞瘤和卵巢癌中被发现。然而,其对卵巢癌的生物学功能目前尚不清楚。在本课题中,我们对de4EGFR在上皮性卵巢癌中的表达,以及其对上皮性卵巢癌细胞增殖、侵袭力及耐药性进行了研究。第一部分de4EGFR在上皮性卵巢癌中的表达及生物学功能目的检测de4EGFR在上皮性卵巢癌组织中的表达及其对上皮性卵巢癌细胞生物学行为如增殖、侵袭等的影响。方法通过RT-PCR方法对12例正常卵巢组织及72例上皮性卵巢癌组织中de4EGFR的表达进行检测；体外实验中,通过慢病毒感染的方法在三种不同上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、CAOV3、ES2中过表达EGFR及de4EGFR,并通过Westernblot方法验证其过表达的效率。通过CCK-8实验观察其对细胞增殖的影响,通过Transwell实验观察其对细胞转移与侵袭的影响；体内实验中,通过在裸鼠体内成瘤的方法评估de4EGFR对裸鼠体内瘤体大小与肿瘤重量的影响。结果研究结果显示在上皮性卵巢癌组织有48.6%(35/72)的de4EGFR表达。在正常卵巢组织中未检测到de4EGFR的表达。在Ⅲ-Ⅳ期的上皮性卵巢癌组织中,de4EGFR的表达阳性率明显高于Ⅰ-Ⅱ期的上皮性卵巢癌组织。体外实验中,通过CCK-8实验的生长曲线发现,与GFP对照组相比,过表达de4EGFR的细胞株与过表达EGFR的上皮性卵巢癌细胞株具有相似的促进肿瘤细胞增殖的能力(P<0.05或P<0.01)。在体外成瘤实验中,相比于GFP组,EGFR和de4EGFR组更能促进肿瘤的生长(P<0.01和P<0.05)。但是EGFR和de4EGFR组之间没有显著差异。Transwell实验发现过表达de4EGFR的SKOV3细胞的侵袭能力比对照组要高两倍(P<0.001),在其余的细胞株CAOV3、ES2中也观察到相同的现象(P<0.001)。结论de4EGFR在上皮性卵巢癌组织中普遍表达,并与临床分期正相关。de4EGFR可以促进上皮性卵巢癌细胞的增殖并且与EGFR相比其具有更强的促进上皮性卵巢癌细胞侵袭的能力。第二部分de4EGFR促进上皮性卵巢癌细胞侵袭的分子机制研究目的研究de4EGFR促进上皮性卵巢癌细胞侵袭能力的相关分子机制。方法通过慢病毒感染的方法在三种不同上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、CAOV3、ES2中过表达de4EGFR,采用Westernblot方法检测de4EGFR自身磷酸化及EGF刺激后磷酸化的情况,并研究de4EGFR对下游信号通路以及与侵袭相关因子Src,FAK,MMP-9和E-cadherin的影响。通过siRNA干扰的方法下调过表达de4EGFR细胞株SKOV3、ES2中FAK的表达,以观察FAK相关信号通路的变化及侵袭相关因子的改变；同时采用Transwell方法,在过表达de4EGFR细胞株SKOV3中下调FAK的表达水平后,观察上皮性卵巢癌细胞侵袭的变化。结果Westernblot检测发现,de4EGFR在上皮性卵巢癌细胞中具有更高的自身酸磷酸化水平,且对EGF刺激不敏感。相比于GFP对照组及过表达EGFR的上皮性卵巢癌细胞,过表达de4EGFR组可以明显上调ERK、AKT、Src和FAK的磷酸化水平,并且上调MMP-9而下调E-cadherin的表达。在过表达de4EGFR细胞株SKOV3中通过siRNA干扰下调FAK的表达水平后,明显抑制上皮性卵巢癌细胞的侵袭能力(P<0.05)。此外,下调FAK的表达水平后,在过表达de4EGFR细胞株SKOV3、ES2中可下调Src,ERK,AKT的磷酸化水平及MMP-9的表达,而上调E-cadherin的表达。结论de4EGFR可能通过上调FAK磷酸化水平持续激活AKT和ERK通路,随后增加MMP-9的表达,并下调E-cadherin的表达从而增强上皮性卵巢癌细胞的侵袭能力。第三部分de4EGFR促进上皮性卵巢癌细胞对顺铂耐药的初步研究目的研究de4EGFR在上皮性卵巢癌细胞中对于顺铂耐药的作用。方法在转染GFP、EGFR、de4EGFR的两种不同上皮性卵巢癌细胞株SKOV3和CAOV3中,用不同剂量顺铂作用细胞后,通过CCK-8方法观察顺铂对肿瘤细胞生长情况的影响,并用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡情况。进一步通过Westernblot检测顺铂处理上述细胞后相关信号通路如AKT,ERK及凋亡相关因子如Bcl-2与Bad的变化。结果de4EGFR过表达的上皮性卵巢癌细胞SKOV3对顺铂的抑制率及凋亡率较GFP组及EGFR组明显降低(P<0.001及P<0.01)。在CAOV3细胞中观察到了相似的结果。相比于GFP组及EGFR组,转染de4EGFR的上皮性卵巢癌细胞AKT、ERK分子磷酸化水平升高,而且细胞中凋亡相关因子如Bcl-2表达上调、Bad表达下调。结论de4EGFR可以增强上皮性卵巢癌细胞对顺铂的耐药,其程度比EGFR更高。de4EGFR可能通过激活AKT和ERK通路以及上调Bcl-2、下调Bad的表达,从而使上皮性卵巢癌细胞产生对顺铂的耐药。
【作者】张彭南；
【导师】孙红；
【作者基本信息】复旦大学，妇产科学，2013，博士
【关键词】表皮生长因子受体；de4EGFR；上皮性卵巢癌；侵袭；顺铂耐药；

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