高选择性高灵敏度糖肽富集及质谱检测新技术与新方法

【摘要】本论文针对糖蛋白质组和糖肽组研究中糖基化多肽质谱检测所面临的糖肽含量少、非糖肽干扰大、检测灵敏度低等热点难点问题,发展了硼酸功能化介孔纳米材料(MCM-41-GLYMO-APB,MCM-41-APTES-CPB)和肼功能化聚合物磁性纳米复合材料(Fe3O4@PMAH),实现了糖基化多肽的高选择性分离富集和高灵敏度质谱检测,并成功用于高特异性揭示复杂生物样品大鼠血清和蝰蛇蛇毒中的糖肽组以及肠癌病人血清中糖蛋白质的鉴定。糖基化作为蛋白质最常见、最重要和最复杂的翻译后修饰之一,具有极其重要的生物学意义。糖基化修饰可影响蛋白质三维空间结构或决定蛋白质在细胞内的转送方向等,在细胞与基质间的识别、信号转导、发育与分化过程中都起着重要作用。研究表明,糖链的变化与肿瘤的发生与发展密切相关,目前发现的超过一半的癌症相关生物标志物都是糖基化蛋白质和糖基化多肽。因此,糖蛋白和糖肽的研究对于临床疾病的早期诊断以及生物标志物的发现等具有极其重要的意义。然而,尽管哺乳动物蛋白质中超过50%发生了糖基化,但是糖基化肽段却仅占到蛋白质酶解肽段的2-5%；并且糖链的微观不均一性进一步减少了糖肽的相对量和降低了检测的灵敏度；在质谱分析的过程中,糖肽的质谱信号很容易受到非糖肽的抑制,因此糖基化的研究充满挑战。如何将糖肽从复杂体系中高选择性地分离出来并达到质谱可以检测的水平,是糖蛋白质组研究首先要解决的一个关键问题。多肽组,即蛋白质组中低分子量的部分,自2001年首次被提出后,在最近十来年中已经引起了大家持续的关注。一般认为血清样品中含有一些低分子量循环蛋白和肽段,而这些小分子量部分则是获取信息的丰富资源。通过质谱分析生物样品中的多肽组可以潜在地提供癌症和其他疾病的诊断和早诊信息。蛇毒是从蛇毒腺中分泌的许多具有药理学活性的功能性酶及多肽的复杂混合物。它可以麻痹和杀死猎物,也是开发新型药物的宝贵资源。研究毒液多肽非常重要,有利于挖掘具有治疗应用潜力的生物活性分子。尽管目前关于多肽组重要性的认识已经日趋增加,然而极少有关于翻译后修饰多肽组的报道,主要是如下一些困难阻碍了糖肽组的研究。首先,复杂生物样品中的蛋白组具有极高的动态范围,使得糖肽组的分析非常具有挑战性。其次,与多肽组相似,糖肽组的分子量大多小于20kDa,而这正是传统蛋白质组学技术难以覆盖到的区域。最后,与非糖基化肽段相比,糖基化肽段常常以相对低的丰度存在(2%-5%),并且糖链的微观不均一性进一步减少了糖基化肽段的相对量和降低了检测的灵敏度。因此,迫切需要发展一种能克服传统研究方法局限性能用于糖肽组研究的特定方法。针对以上糖蛋白质组和糖肽组研究中糖基化多肽的分离富集和质谱检测的问题,本博士学位论文分为五个章节开展研究工作。各章节主要内容如下：第一章绪论部分。本章主要论述了基于生物质谱的多肽组学研究进展,糖基化蛋白质组学研究技术策略概述,以及纳米材料在糖蛋白质组学研究中的应用。详细论述了多肽提取样品前处理方法的发展现状及遇到的挑战,当前糖基化蛋白质组学研究分离与富集技术策略的比较及总结,适用于糖蛋白质组学富集研究目的各种纳米材料的发展现状。从而引出本论文工作的研究方向,为设计发展高选择性高灵敏度糖肽富集和质谱检测新技术与新方法提出理论依据和实际意义。第二章针对糖蛋白质组研究中如何将糖肽从复杂体系中高选择性地分离出来并达到质谱可以检测的水平这个关键问题,以及糖肽组研究中关于内源性糖肽提取尚无合适样品前处理方法的问题,设计合成了硼酸功能化介孔纳米材料用于选择性富集糖肽。介孔材料MCM-41具有很大的比表面积(≈1000m2/g)适合作为硼酸基团改性修饰的基底材料,而且其孔道尺寸(2.1-2.7nm)和六方柱状孔道结构具有尺寸排阻效应使其非常适合于多肽组的研究,硼酸功能化MCM-41则为其应用于生物样品中糖肽组的研究提供了可能。本章第一节中选取介孔纳米材料MCM-41作为基底材料,在水相中对其进行硼酸功能化表面改性,红外表征,并对其用于糖肽富集的条件进行了考察和优化,最终建立了一种硼酸功能化介孔纳米材料MCM-41-GLYMO-APB用于选择性富集糖肽并用基质辅助激光解吸附电离-四极离子阱-飞行时间质谱(MALDI-QIT-MS)进行糖肽分析的方法。本章第二节为了解决上述硼酸功能化介孔纳米材料MCM-41-GLYMO-APB在糖肽组研究中可能存在接枝效率不高以及不利于保持MCM-41六方柱状孔道的有序介孔结构的问题,我们改进了材料的合成方法,又设计了在有机相中制备一种硼酸功能化介孔纳米材料MCM-41-APTES-CPB。采用多种技术手段对此材料进行表征,并优化了其用于糖肽富集的条件,使其同时具有更高的糖肽富集效率、更高的糖肽富集特异性以及更高的质谱兼容性。MCM-41-APTES-CPB在糖肽/非糖肽的摩尔比例达到1：100时对糖肽仍然具有优秀的选择性,极好的灵敏度(检出限为fmol级),良好的富集容量(40mg/g-1),以及很高的糖肽富集回收率(88.10%)。第三章为了解决血清糖肽组研究中存在血清蛋白的高动态范围、蛋白质组学传统的样品制备技术不能有效覆盖低分子量蛋白、以及糖肽的相对低丰度的困难,建立了硼酸功能化介孔纳米材料用于高特异性揭示血清糖肽组的方法以克服当前研究方法的不足。糖肽组研究中样品的预处理方法不仅需要能有效提取多肽还必须对糖肽具有特异性。目前尚没有能应用于糖肽组研究的合适样品前处理方法。本章在第二章研究的工作基础上,利用介孔纳米材料MCM-41的开口孔径尺寸与多肽尺寸匹配的特点,结合MCM-41内孔孔径修饰硼酸基团后可以快速高效富集糖肽的特点,建立了以生物质谱为基础的利用硼酸功能化介孔纳米材料MCM-41-APTES-CPB高特异性揭示大鼠血清糖肽组的方法。对硼酸功能化介孔纳米材料用于糖肽组研究的可能性进行了验证,该制备的材料同时具有对糖肽合适的介孔孔径以及丰富的硼酸基团能特异性富集糖肽的性质,大分子蛋白被排阻在孔径外,糖肽则进入孔道内,从而特异性地富集血清中内源性糖肽。将硼酸功能化介孔纳米材料MCM-41-APTES-CPB成功应用于大鼠血清糖肽组的研究,富集并鉴定了15条内源性糖肽以及对应的15个糖基化位点。第四章针对蛇毒糖肽组研究几乎为空白的情况建立了利用硼酸功能化介孔纳米材料高特异性揭示蛇毒糖肽组的方法。尽管关于蛇毒蛋白质组的研究快速增长,蛇毒多肽组的鉴定却没有进展很快,而蛇毒糖肽组则鲜有研究。为了高特异性揭示蛇毒糖肽组,我们建立了以生物质谱为基础的利用硼酸功能化介孔纳米材料MCM-41-APTES-CPB揭示蛇毒糖肽组的方法。为了验证该方法的有效性,我们将多肽组提取和糖肽富集研究中常用的技术结合,采用四种不同的方法,包括乙腈沉淀法、超滤法、乙腈沉淀结合肼树脂富集法和超滤结合肼树脂富集法分别对蛇毒中的糖肽组进行富集。结果表明,这五种方法中利用硼酸功能化介孔纳米材料MCM-41-APTES-CPB富集蛇毒糖肽组的方法特异性最好(达到44%),富集糖肽的数目最多(11条糖肽),且操作简便省时。总共鉴定到十五条糖肽和十五个糖基化位点,对应于10个前体蛋白,这些糖肽均为首次被鉴定,高特异性揭示了蝰蛇蛇毒的糖肽组,并为其中八个前体蛋白在蛋白水平的存在提供了实验依据。硼酸功能化介孔纳米材料富集结合高精密度质谱鉴定的新方法为蛇毒中糖基化肽段的提取、释放和鉴定建立了一种简单而有效的流程,这种技术在高度特异性发现作为具有潜在临床药物应用价值的蛇毒糖肽方面非常具有发展潜力。第五章将肼基树脂和磁性纳米材料各自的优势结合起来,制备一种具有高密度肼基团的磁性纳米材料,使其既有丰富的肼基团能够高特异性富集糖肽,又有磁性内核易于分离适用于更便捷的糖蛋白质样品处理,并用于肠癌病人血清中糖蛋白组的研究。先利用蒸馏沉淀聚合法将含有大量羧基末端的聚合物包覆至纳米磁性核心表面,再将己二酸二酰肼通过酰胺键键合至羧基聚合物磁性纳米材料表面,得到肼功能化聚合物磁性纳米复合材料(Fe3O4@PMAH)。此制备材料的肼基团密度为154±11μmol/g,磁饱和值为25emu/g,具有丰富的肼基团和优良的磁响应。与肼树脂相比,Fe3O4@PMAH对于糖肽富集的信噪比提高了五倍以上将Fe3O4@PMAH应用于肠癌病人血清酶解物中糖肽的富集,三次实验操作测定的重现性良好,共鉴定到175条糖基化肽段,181个糖基化位点,对应于63个糖基化蛋白。对于实际样品中糖肽富集的特异性达到70%,糖蛋白的特异性达到80%。Fe3O4@PMAH对于糖肽具有良好的富集效果,且易于分离,操作方便,有望用于大规模高通量自动化的样品处理中。
【作者】刘丽婷；
【导师】陆豪杰；
【作者基本信息】复旦大学，分析化学，2013，博士
【关键词】糖蛋白质组学；糖肽组学；糖蛋白质；糖肽；富集；质谱；血清；蛇毒；硼酸化学法；肼化学法；硼酸功能化介孔纳米材料；肼功能化聚合物磁性纳米复合材料；

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