重组双功能水蛭素结构与功能研究及新型直接凝血酶抑制剂的设计

【摘要】随着人们生活水平的不断提高及社会老龄化问题的日益严重,心脑血管血栓性疾病发病率和致死率非常高,是中老年人的常见病和多发病,严重威胁人类的健康。临床上常见的急性心肌梗塞、脑血栓和弥漫性血管内凝血(DIC)多数为动脉血栓,是致死或致残的主要原因之一；血液凝固异常是这一类疾病的发生、蔓延及干预中最为关键的环节。血栓性疾病在急性发病前需及早干预治疗,发病后经溶栓治疗,需要长期用药,预防血栓再次形成而复发。肝素和维生素K是临床上常用的抗凝治疗药物,已有近百年的历史。然而,在临床使用过程中,不断地发现肝素、维生素K等用于抗凝治疗时会引发不良反应,限制了它们的使用范围。而凝血酶作为血液凝固的关键因子,成为临床上预防血栓形成的重要靶点。水蛭素是特异性的凝血酶抑制剂,并且是一种直接凝血酶抑制剂(directthrombininhibitors,DTIs),临床上用于防治血栓疾病,有着重要的应用价值。我们实验室研制、开发了重组双功能水蛭素(RGD-Hirudin),中国发明专利“一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用”已授权,专利号：ZL01105798.X。RGD-Hirudin是在野生型水蛭素分子的合理部位融合了Arg-Gly-Asp(RGD)三肽,使这种水蛭素衍生物既保留了抗凝血酶活性,又增加了抑制血小板聚集的活性,具有降低血黏度,抗栓、防栓等作用。经过药效学研究证明用于血管吻合术后抗凝治疗,疗效优于野生型水蛭素和肝素。但是RGD-Hirudin是一种蛋白质/多肽类药物,只能通过静脉注射的给药方式用药,临床应用范围有限。目前,已有四种注射用DTIs及一种口服DTI成功用于临床。然而,这些药物的临床适应症状单一,每种DTI都针对特定的病症,且治疗费用昂贵。所以,开发新型DTIs(包括注射和口服给药方式)无论在治疗和预防血栓栓塞疾病方面还是在经济效益方面都具有极为广阔的前景。本项研究的主要目的是从重组双功能水蛭素的结构和功能研究入手,发现其与凝血酶相互作用的重要位点,阐明两者相互作用机制,对双功能水蛭素作进一步的改造,设计和研制具有抗凝活性的小分子多肽,用于开发口服或皮下注射的抗凝防栓药物。本论文研究内容主要包括四个部分：1.利用毕赤酵母表达系统,通过高密度发酵的方法,采用适当纯化方案,以13C甘油、13C甲醇分别为生长阶段和诱导阶段提供碳源；以15N硫酸铵为氮源,对RGD-hirudin作15N/13C均一标记,经发酵和纯化,获得15N/13C全标记RGD-hirudin,对其纯度、分子量及生物学活性进行了鉴定,为深入开展构效关系研究打下了良好的基础。2.利用多维核磁共振技术,对15N/13C均-标记的RGD-hirudin作了1D’H谱,3DCBCA(CO)NH谱,3DCBCANH谱,3DHNCO谱,2D1H-15NHSQC谱的测定,并对骨架共振信号进行了归属指认。利用化学位移扰动实验研究了15N/13C均匀标记的RGD-hirudin与凝血酶的相互作用位点,明确了RGD-hirudin的关键氨基酸残基位点。3.利用同源建模的方法模拟了RGD-hirudin的全长结构,通过分子对接的方法得到RGD-hirudin与凝血酶复合物的模型结构,结合NMR化学位移扰动实验的结果,对RGD-hirudin与凝血酶的相互作用进行了深入的分析。为了验证复合体模型的准确性,进一步对两者相互作用过程中,与凝血酶形成氢键的RGD-hirudin氨基酸残基进行了虚拟丙氨酸扫描,分析突变体稳定性及合理性。利用重组DNA技术,将计算机模拟得到的关键氨基酸残基作丙氨酸单点突变,获得了6个RGD-hirudin的突变体。测定了这些突变体的抗凝活性和抗血小板聚集的活性；利用表面等离子共振实验(SPR)分别测定了RGD-hirudin和这些突变体与凝血酶相互作用的亲和力。确认RGD-hirudin与凝血酶相互作用关系,即RGD-hirudin的C-末端与凝血酶exositesI结合,N-末端与凝血酶活性位点结合,抑制凝血酶活性。4基于RGD-hirudin的结构功能研究结果,以RGD-hirudin的序列为基础,保留其与凝血酶结合的功能氨基酸残基,借助分子模拟软件(DiscoveryStudio3.0)设计了两条具有抗凝活性的小分子短肽。以毕赤酵母为宿主菌表达上述短肽肽,纯化后测定抗凝血酶活性,HPLC测定纯度,MS测定分子量,结果显示两条短肽具有抗凝活性,分子量分别为3925.5247Da(35肽)和4024.5459Da(36肽)。
【作者】黄一农；
【导师】于敏；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学与分子生物学，2013，博士
【关键词】毕赤酵母；水蛭素；重组双功能水蛭素；凝血酶；核磁共振；计算机；模拟；表面等离子共振；

【参考文献】
[1]白学峰.基于滑转率的拖拉机自动耕深控制系统研究[D].南京农业大学,车辆工程,2012,硕士.
[2]高洁.基于B/S/S架构的汽车维护与保养系统的设计与实现[D].天津大学,软件工程,2013,硕士.
[3]党晶.制造业中疲劳因素对作业效能影响的测评研究[D].中北大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[4]郭猛.洛阳市农业信息化现状、问题与对策分析[D].河南科技大学,农业信息化（专业学位）,2013,硕士.
[5]段曙凯.飞机蒙皮法矢的视觉检测技术研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[6]刘景旭.年贮1万吨生鲜果蔬保鲜冷库的工厂设计[D].江西农业大学,食品加工与安全,2012,硕士.
[7]张远志.超声图像甲状腺肿瘤自动检测方法研究[D].西南交通大学,计算机技术,2014,硕士.
[8]王芳妮.任务型教学在少儿英语教学中的应用研究[D].西北大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[9]王冲.肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6在扁平苔藓皮损中的表达及意义[D].山西医科大学,皮肤病与性病学（专业学位）,2013,硕士.
[10]张欣.湖北省建筑业专业技术人员继续教育模式研究[D].武汉理工大学,2005.
[11]罗媛媛.基于YCbCr颜色空间的森林火灾探测技术的研究[D].中南林业科技大学,农业信息化,2013,硕士.
[12]黄晓敏.贵阳市城镇化进程中农民法律意识调查[D].贵州民族大学,法律,2013,硕士.
[13]王露莹.汉字简化与汉字教学研究[D].扬州大学,学科教学,2011,硕士.
[14]郭博雅.东北大鼓腔词研究[D].沈阳音乐学院,音乐学,2013,硕士.
[15]覃欢欢.6R工业机器人整体刚度建模与弹性动力学分析[D].华中科技大学,动力机械及工程,2013,硕士.
[16]曹禄.城乡统筹发展背景下的公共物品均等化供给研究[D].长安大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[17]邱林.土耳其XX地铁更新项目标前风险管理研究[D].西南交通大学,项目管理,2012,硕士.
[18]李迎辉.基于象限划分的多元投融资主体建设协同管理研究[D].重庆交通大学,技术经济及管理,2011,硕士.
[19]梁雪峰,曾国宏,姜久春.3kW光伏并网逆变器硬件设计[J].电力电子技术,2008,08:28-29+78.
[20]胡能文.毫米波测试系统的参数测量方法研究[D].南京理工大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[21]王丽娜.马克思劳动价值论的形成及围绕劳动价值论的论争[D].河南大学,政治经济学,2004,硕士.
[22]刘玉振.农业上市公司产业组织模式与绩效研究[D].新疆农业大学,农业经济管理,2012,硕士.
[23]侯贝贝.软骨肉瘤中WIF-1基因甲基化及Wnt-5a蛋白表达的研究[D].山东大学,病理学与病理生理学,2012,硕士.
[24]韩舒展,惠卫军,刘荣佩,邵成伟.回火温度对30CrMnSiA钢氢致延迟断裂行为的影响[J].材料热处理学报,2014,07:114-119.
[25]马晓勤.金属拱型波纹屋盖结构的有限元分析及星载抛物面天线的赋形设计[D].浙江大学,结构工程,2004,硕士.
[26]雷前.超高强CuNiSi系弹性导电铜合金制备及相关基础研究[D].中南大学,材料科学与工程,2014,博士.
[27]郭婧.关于有效控制我国贫富差距扩大的思考[D].宁波大学,马克思主义中国化,2013,硕士.
[28]陈泽华,张裕,谢刚.不一致决策表规则获取的粒计算方法[J].控制与决策,2015,04:709-714.
[29]王倩.RECK及明胶酶A、明胶酶B在子宫主韧带中的表达及其与盆底功能障碍性疾病的关系[D].河北医科大学,妇产科学,2013,硕士.
[30]张磊.美日中央银行金融危机管理比较研究[D].辽宁大学,金融学,2014,博士.
[31]朱慧红.房屋租赁中的附合法律问题研究[D].北京化工大学,民商法学,2013,硕士.
[32]梅洪萍.健脾利湿中药治疗乳腺癌术后上肢水肿的疗效观察[D].浙江中医药大学,中医外科学,2013,硕士.
[33]桂萍.中国榕属无花果亚属（Ficus subg.Ficus）的形态解剖学研究[D].华东师范大学,植物学,2013,硕士.
[34]周宁.21世纪信息组织与检索的可视化、智能化发展方向[J].现代图书情报技术,2002,04:4-6.
[35]杨诗鸿,盛旭军,何小新,吴庆鸣.运用机械模块学促进水利机械的发展[J].中国水利.2003(03)
[36]李民.行业新闻网站的建设与运作[J].中国新闻科技.2001(01)
[37]乔玉娇.山东省农产品出口贸易战略研究[D].山东财经大学,国际贸易学,2012,硕士.
[38]霍曼芳.诗与思的美妙平衡[D].河北师范大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[39]谷申杰.书院制视野下的高校学生工作创新研究[D].西北农林科技大学,职业技术教育学,2012,硕士.
[40]刘财,冯晅,张瑾.稳定的迭代法反Q滤波[J].石油地球物理勘探,2013,06:890-895+1016+848.
[41]李涛.决策形式背景的知识获取[D].西北大学,应用数学,2013,硕士.
[42]王静.磷促进高硫合成气制备甲硫醇钾钼催化剂的研究[D].合肥工业大学,应用化学,2013,硕士.
[43]武二虎.马克思市民社会思想对构建中国市民社会的价值研究[D].西南大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[44]徐红艳.学案导学教学模式在高中英语教学中的应用研究延安中学为例[D].延安大学,课程与教学论,2014,硕士.
[45]张晓艳.光影在园林景观中的审美与应用研究[D].齐鲁工业大学,设计艺术学,2014,硕士.
[46]梁岩.论住宅设计风格中的个性化设计[D].内蒙古师范大学,美术学,2013,硕士.
[47]郭颖.厦门市曾厝垵社区空间结构分析及设计研究[D].厦门大学,建筑设计及其理论,2014,硕士.
[48]王云锋.一种基于线阵CCD的液位测量装置的光路设计与实验研究[D].哈尔滨工程大学,光学工程,2012,硕士.
[49]黄荣怀,张振虹,陈庚,徐琤.网上学习:学习真的发生了吗?——跨文化背景下中英网上学习的比较研究[J].开放教育研究,2007,06:12-24.
[50]衡向东.海上货物保险利益判断标准问题研究[D].大连海事大学,法学,2013,硕士.