法医毒理学中药物代谢与中国汉族人群CYP基因多态性的关联分析

【摘要】涉毒案件是法医学鉴定的重要内容之一。由于人类对毒药物的代谢存在显著的个体差异,因而中毒案件的法医毒理学分析应充分考虑个体遗传因素,结合药物基因组学进行结果解释。细胞色素P450(CytochromeP450,CYP)是人体中最重要的药物代谢酶。遗传机制的研究显示,药物代谢的个体差异主要由CYP基因多态性所致,若CYP基因出现碱基缺失、插入、替换、颠换等类型的突变,就会使氨基酸序列改变,导致所表达的CYP酶降低活性或者丧失活性,最终引起药物代谢异常而中毒。单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)在人类基因组中数量较多,发生频率较高,在疾病相关性研究、药物基因组学、法医学等研究中发挥了重要作用。近年来基于SNP分型的药物基因组学逐渐在毒理学研究方面崭露头角,其不仅可用于筛选异常代谢人群,也可为毒理学作用机制的研究提供新的方向和方法。基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrum,MALDI-TOFMS)基因分型技术因其高灵敏度、高特异性、高通量等优点,更符合法医生物学检材的要求,适用于CYP基因的SNP位点分型。生物样品前处理方法一直以来是毒物分析的一个研究难点。分子印迹技术(Molecularimprintingtechnique,MIT)是近几年发展起来的新型分子识别分离技术,因其识别性好、专一性高,可应用于生物检材中毒药物及其代谢物的分离分析。本论文在国内首次针对中国汉族人群CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4和CYP1A2基因座上的50个SNP位点进行了大规模筛查分析,并在现有研究成果以及现代毒物分析技术和SNP分型技术的研究基础和起点上,以司法鉴定实践中广泛涉及的新一代非“苯二氮卓”药物唑吡坦(Zolpidem,思诺思)和阿片类药物可待因为研究对象,创建了体内毒药物及其代谢物的筛选分析体系和确证定量方法,自主研发了唑吡坦分子印迹固相萃取小柱并申请专利,用于血液和尿液中唑吡坦的分离分析。通过志愿者实验,首次考察了中国汉族人群中CYP基因多态性的分布情况,首先报道了CYP基因多态性与唑吡坦及可待因代谢之间的关系,在国内率先进行了将药物基因组学应用于法医毒理学的探索研究。主要的研究内容分为以下七部分：第一部分CYP基因分型方法的研究及评价研究显示,CYP2D6,CYP2C19,CYP2C9,CYP3A4和CYP1A2参与了大部分的药物代谢。筛选出这些基因座上的50个SNP位点,创建了基于复合PCR和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术的CYP基因分型方法,并检测了200例健康中国汉族人群的血样,得到了这50个SNP位点的基因分布频率。引物是根据MassARRAYAssay设计软件设计,由0.5mL全血抽提基因组DNA,经过复合PCR得到含SNP位点的片段。MALDI-TOF-MS检测之前再经过单碱基延伸和产物纯化,即得到检测结果。同时以已知基因型的DNA样品作为质量控制样品。结果发现,CYP2D6,CYP2C19,CYP2C9,CYP3A4和CYP1A2基因座上的17个SNP位点具有多态性。首次报道8个位点(rs16947,rs28371725,rs1800754,rs4244285,rs4986893,rs12248560,rs3758580,rs2242480)的分布频率在中国汉族人群和高加索人群中存在显著性差异(p<0.01),2个位点的分布频率和现存中国汉族人群分布频率之间存在显著性差异(p<0.01)。通过验证,所建立的MALDI-TOF-MSSNP分型方法的准确度是100%。因此,该方法检测结果可信且适用于高通量的基因分型研究,提高了法医毒理学中毒药物相关基因筛选的效能。第二部分常见毒药物的LC-MS/MS筛选体系的建立为了研究体内毒药物的代谢情况,创建了生物检材中170种常见毒药物的液相色谱串联质谱(Liquidchromatography-tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)筛选分析体系。采用多反应监测(Multiplereactionmonitoring,MRM)模式,以目标物的保留时间和母离子／子离子对为指标进行筛选分析。建立了LC-MS/MS库和定性认定标准,并考察了分析方法的有效性。多反应监测筛选体系兼具有选择离子扫描的灵敏度和二级质谱的特征性,血液中170种毒药物筛选分析的最低检出限为0.1～10ng/mL,其中85%的毒药物检出限≤1ng/mL,达到国际领先水平。该筛选分析体系能满足法医毒物分析和临床毒物学检测中毒或治疗浓度目标物的需要,为其他多种药物代谢与CYP基因多态性的关联分析提供了技术储备,在司法鉴定实践中有重要的应用价值。第三部分唑吡坦分子印迹固相萃取柱的制备及应用生物样品尤其是血液、尿液中目标物的分离分析技术是本课题研究的基础。目前,生物检材中的唑毗坦分析,主要采用液液提取或固相萃取等前处理后进行液相色谱串联质谱分析。分子印迹技术(Molecularimprintingtechnique,MIT)是近几年发展起来的新型分子识别分离技术,因其识别性好、专一性高,可应用于生物检材中毒药物及其代谢物的分离分析。本课题以唑吡坦为模板,自主研发了特异性强、选择性高的分子印迹聚合物提取柱,建立了相应的分子印迹固相萃取方法,并申请了一项发明专利。以血液为检材,提取物用UPLC-MS/MS方法检测分析。对该方法进行方法学验证,并与传统的固相萃取技术进行了比较,发现该分子印迹固相萃取柱选择性强、灵敏度高(最低检测限为0.2ng/mL),适用于法庭科学领域唑吡坦相关实际案例的检测分析。第四部分UPLC-MS/MS法检测血液、尿液中的唑吡坦及其代谢物为研究唑吡坦的体内代谢情况,本课题首次建立了同时检测生物检材中唑吡坦及其主要代谢物6-羧酸唑吡坦(zolpidem6-carboxylicacid,ZCA)及苯基-4-羧酸唑吡坦(Zolpidemphenyl-4-carboxylicacid,ZPCA)的超高效液相色谱串联质谱(Ultra-performanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry,UPLC-MS/MS)分析方法,并应用于鉴定实践。取0.1mL血液或尿液,加入0.9mL的乙腈(含0.1%甲酸)进行蛋白沉淀。离心后取上清液吹干,用100μL甲醇定容后进API4000Q分析,分析柱为AcquityTMUPLCHSST3(100mm×2.1mm,1.8μm)柱。流动相为乙腈和水(含20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸),流速为0.5mL/min。血液中唑吡坦,ZPCA及ZCA的线性范围分别为0.1-300ng/mL,0.1-500ng/mL,0.1-200ng/mL,尿液中唑吡坦,ZPCA及ZCA的线性范围分别为0.1-600ng/mL,0.1-600ng/mL,0.1-300ng/mL。三种化合物的检出限和定量限分别为0.05ng/mL和01ng/mL,方法的线性相关性≥0.9995,日间和日内精密度在10%以内,回收率为70.0-98.3%,基质效应为79.5-99.0%。该方法简单、快速、灵敏,能够有效地解决唑吡坦涉药案件,提高突发案(事)件的快速鉴定能力。第五部分唑吡坦代谢与CYP基因多态性的关联性分析以临床广泛应用,并在药物辅助犯罪案件(Drug-facilitatedsexualassault,DFSA)中经常涉及到的新一代非“苯二氮卓”药物唑吡坦为研究对象,为了考察唑吡坦代谢与CYP基因多态性的关联性,选取200名汉族健康志愿者分析其基因型,筛选出具有突变基因的人群并分为4组：CYP3A4*18(wild-type,W),CYP2C19*2(W);CYP3A4*18(mutant,M),CYP2C19*2(W):CYP3A4*18(W),CYP2C19*2(M);CYP3A4*18(M),CYP2C19*2(M).志愿者口服治疗剂量的酒石酸唑吡坦后采集其血液、尿液样品进行分析。结果发现,唑吡坦的氧化代谢主要是通过细胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。首次报道,若发生CYP3A4*18的突变,则会增强CYP3A4酶的活性,从而引起该基因突变人群对唑吡坦的代谢增强；若发生CFP2C19*2的突变,则会降低CYP2C19酶的活性,从而引起中国汉族人群对唑毗坦的弱代谢。该研究成果提出,不同人群对唑吡坦的代谢存在个体差异,解释相关案件时应充分考虑个体遗传因素。第六部分UPLC-MS/MS法检测尿液中的可待因及其代谢物为研究可待因的体内代谢情况,本课题创建了尿液中可待因及其代谢物的超高效液相色谱串联质谱分析方法。以吗啡-d3(MOR-d3)和吗啡-3-葡萄糖醛酸苷d3(M3G-d3)为内标,尿样用乙腈沉淀蛋白后,过SiroccoTM蛋白沉淀板,UPLC-MS/MS法分离检测尿样的中吗啡(MOR)、吗啡-3-葡萄糖醛酸苷(M3G)、吗啡-6-葡萄糖醛酸苷(M6G)和可待因(COD)。尿样中COD的检出限为0.2ng/mL,定量限为0.5ng/mL;MOR、M3G和M6G检出限为0.5ng/mL,定量限为1ng/mL;线性相关系数r≥0.999　7;日内精密度在5%以内,日间精密度在10%以内；日内准确度大于97%,日间准确度大于94%,回收率在90%以上,基质效应在45%-90%。所建方法简便、快速、准确,可适用于法医毒理学中可待因相关案件的分析鉴定。第七部分可待因代谢与CYP基因多态性的关联性分析以临床广泛应用,并易造成滥用成瘾的药物可待因为研究对象,为了考察可待因代谢与CYP基因多态性的关联性,选取20名健康志愿者口服治疗剂量的复方磷酸可待因口服溶液后分时段留尿,采用UPLC-MS/MS方法检测。本研究发现,多数志愿者在单次给药0.5h内,MOR、COD浓度即达到峰值,而M3G浓度则在1h后达到峰值,M6G浓度在6h时达到峰值。另有2名志愿者因rs2242480基因突变(CYP3A4),其吗啡峰值出现在72h,M3G和M6G峰值也出现在72h,可待因的峰值出现在80h。结果表明,该2名志愿者可能为可待因慢代谢者(PM),摄入的可待因在人体内代谢缓慢,易造成药物蓄积。同时指出,CYP2D6基因突变易造成超强代谢者(UM),导致吗啡过量而引起中毒,但本项研究尚未发现有超强代谢者。小结本课题创建了基于复合PCR和MALDI-TOFMS的中国汉族人群CYP基因座上50个SNP位点的基因分型方法,首次报道8个位点的分布频率在中国汉族人群和高加索人群中存在显著性差异(p<0.01),2个位点的分布频率和现存中国汉族人群分布频率之间存在显著性差异(p<0.01)。该方法检测结果可信且适用于高通量的基因分型研究,提高了法医毒理学中毒药物相关基因筛选的效能。同时本研究首次建立了唑吡坦及其代谢物、可待因及其代谢物的UPLC-MS/MS确证定量分析方法,并自主研发了唑吡坦分子印迹固相萃取柱用于唑吡坦的分离分析,申请发明专利一项。本论文还建立了170种毒药物的LC-MS/MS分析筛选体系,为其他多种药物代谢与CYP基因多态性的关联分析提供了技术储备。所建方法简便、快速、准确,能够有效地解决摄毒、涉药案件,提高突发案(事)件的快速反应能力和鉴定效能。在国内率先通过志愿者实验,考察了唑吡坦、可待因代谢与CYP基因多态性的关联性。结果发现：唑吡坦的氧化代谢主要是通过细胞色素氧化酶CYP3A4和CYP2C19的作用。若发生CYP3A4*18的突变,则会增强CYP3A4酶的活性,从而引起该基因突变人群对唑吡坦的代谢增强。若发生CYP2C19*2的突变,则会降低CYP2C19酶的活性,从而引起中国汉族人群对唑吡坦的弱代谢。可待因的代谢主要是通过CYP2D6和CYP3A4,若发生CYP2D6基因突变则易引起超强代谢类型,若发生CYP3A4突变则易会引起可待因弱代谢型。本研究首次报道了CYP基因多态性与唑吡坦及可待因代谢之间的关系,在国内率先进行了将药物基因组学应用于法医毒理学的探索研究,该研究结果可用于解释不同人群对唑吡坦及可待因代谢的差异。本研究指出,个体基因差异对药物代谢的影响在临床医学和法庭科学领域均具有重要的意义。
【作者】施妍；
【导师】沈敏；
【作者基本信息】复旦大学，法医学，2013，博士
【关键词】药物代谢；CYP；基因多态性；唑吡坦；可待因；

【参考文献】
[1]徐飞.基于结构的对于水稻和稻瘟病菌相互作用所包含蛋白的计算研究[D].浙江大学,2009.
[2]陈梦纯.基于《TAP TAP》游戏交互方式的评估思考[D].上海大学,艺术设计,2014,硕士.
[3]罗霄.基层检验检疫机构绩效考核指标体系的构建及完善[D].苏州大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[4]王雅婷.分布式电源接入对配电网保护的影响及新方案研究[D].北京交通大学,2013.
[5]多桑（贝宁）.贝宁航运业的现状及发展研究[D].大连海事大学,交通运输规划与管理,2004,硕士.
[6]马大庆.基于Petri-Net的管网优化综合[D].大连理工大学,化学工程,2013,硕士.
[7]陈虹.健脾益髓膏对重症肌无力患者骨骼肌肌力影响的临床观察[D].广州中医药大学,中医内科学（专业学位）,2013,硕士.
[8]刘洪波.师法自然与成器之道[D].吉林大学,设计艺术学,2013,硕士.
[9]程晓燕.融媒体时代的危机传播[D].华中师范大学,新闻与传播,2013,硕士.
[10]孙建辉,钟武强,袁巧玲,单晓杭,周海清.带有均压槽的环形气浮垫设计[J].轻工机械,2013,05:80-84.
[11]安振英.基于稳健PCA优化算法的视频背景建模研究[D].南京邮电大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[12]田茂义,卢秀山,张燕,马锦.基于Oracle的“数字城市”基础地理空间数据库的实现[J].测绘科学,2005,03:80-82+7.
[13]李进.基于客户价值的个人理财业务发展研究[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[14]吉丽霞,张静宜,曾小鹏,张桢,郭中楠,袁文霞.6H-SiC与熔盐的化学反应[A].中国物理学会X-射线衍射专业委员会、中国晶体学会粉末衍射专业委员会、国家自然科学基金委员会工程与材料科学部、北京市硅酸盐学会、InternationalCentreforDiffractionData,USA.第十届全国X射线衍射学术大会暨国际衍射数据中心（ICDD）研讨会论文摘要集[C].中国物理学会X-射线衍射专业委员会、中国晶体学会粉末衍射专业委员会、国家自然科学基金委员会工程与材料科学部、北京市硅酸盐学会、InternationalCentreforDiffractionData,USA:,2009:4.
[15]桂林,王维俭,孙宇光,王祥珩.大型水轮发电机主保护定量化设计过程的合理简化[J].电力系统自动化,2007,04:101-104.
[16]王鹏.慢加急性肝衰竭患者中乙型肝炎病毒S区基因准种与疾病关系的研究[D].蚌埠医学院,内科学,2013,硕士.
[17]徐钢.浙江省二建建设集团发展战略研究[D].宁波大学,工商管理,2013,硕士.
[18]刘萱.水中NO_3~-/NO_2~-对2,4-D光解影响[D].大连海洋大学,海洋生物学,2014,硕士.
[19]庄世坚.生态文明:迈向人与自然的和谐[J].马克思主义与现实.2007(03)
[20]常澜潇.基于改进挣值法的软件项目进度监控研究[D].南京理工大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[21]孙璐.氧化苯乙烯聚合物的合成、磺化及表征[D].湖北大学,材料学,2011,硕士.
[22]黄勇伟.低轨道皮卫星星上电子系统的研究[D].浙江大学,微电子与固体电子学,2004,硕士.
[23]王红梅.中职语文教学中的爱情教育研究[D].河北师范大学,学科教学,2013,硕士.
[24]罗茜.图的集控制与罗马控制[D].华东交通大学,运筹学与控制论,2013,硕士.
[25]王晓艳.中国电视剧化妆造型审美特征分析[D].上海戏剧学院,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[26]陈一航.提升地方政府环境治理能力面临的挑战及其对策研究[D].湖南师范大学,行政管理,2013,硕士.
[27]陈双德.流动人口的就业状况及其影响因素分析[D].南京大学,人口学,2013,硕士.
[28]黄佳林.韩国城服装销售系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[29]董晓舒.后冷战时代《时代周刊》上的日本国家形象研究-1991-2011[D].吉林大学,世界史,2013,硕士.
[30]张健.精益管理在提升手术室效率中的应用研究[D].西南交通大学,工商管理,2013,硕士.
[31]包万根.实物期权方法在我国风险投资项目管理中的应用[D].浙江大学,企业管理,2003,硕士.
[32]朱永鹏.天地波高频雷达一阶海杂波特性分析与抑制[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2014,硕士.
[33]吴轶凡.张掖丹霞地貌景区开发利用优化方案探讨[D].西南大学,自然地理学,2013,硕士.
[34]李杰.RFID安全认证协议研究与设计[D].西安电子科技大学,密码学,2012,硕士.
[35]李靓.基于直接电流控制的并网逆变技术研究[D].湖北工业大学,电机与电器,2013,硕士.
[36]高文雅.中文文本分类中的关键技术研究[D].湖北大学,系统分析与集成,2012,硕士.
[37]申亚琴.容美土司文学《田氏一家言》研究[D].湖北民族学院,文艺学,2014,硕士.
[38]何婷.基于功能磁共振数据的大脑网络研究及判别分析[D].湖南师范大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[39]毕文静.从世界大赛分析平衡木的发展趋势及我国面临的挑战[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[40]张晓琴.陈晓明学术年谱[J].东吴学术,2014,04:128-147.
[41]许丽媛.重组大肠杆菌利用木糖产高纯度L-乳酸的研究[D].湖北工业大学,发酵工程,2013,硕士.
[42]王振强.微型机函数发生器[J].冶金自动化,1982,05:60-61.
[43]邹倩.丙烯酸酯橡胶发泡材料的制备和性能研究[D].湖北大学,材料学,2012,硕士.
[44]姚敏杰.基于车辆联网的实时路况信息系统研究[D].浙江工业大学,2012.
[45]何俊峰.电液控液压支架远程监控系统研究[D].中国矿业大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[46]刘永杰.异常流量识别系统及其关键技术研究[D].南京邮电大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[47]周俊利.近年来抗战时期募捐研究述评[J].高校社科动态,2013,05:24-30.
[48]杨刚震.农村信息化中物联网技术研究与实现[D].山东大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[49]肖佩.基于两种控制算法的三维桥式吊车系统研究[D].大连理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[50]康壮.基于高阻硅衬底的超导共面波导谐振腔[D].南京大学,2013.