小鼠肾脏缺血再灌注损伤中5hmC的动态变化及其与基因转录的关系

【摘要】目的：DNA甲基化(5mC)和羟甲基化(5hmC)是表观遗传修饰的重要组成部分。已有研究报道了不同组织或器官内基因组5mC和5hmC含量存在差异,但对于不同组织内5mC或5hmC在全基因组的分布规律我们却知之甚少。因此,我们对小鼠不同器官基因组DNA中5mC和5hmC含量进行了验证,并对不同器官DNA甲基组和羟甲基组进行初步分析,观察并总结5mC和5hmC的全基因组分布规律。方法：摘取正常雄性C57小鼠不同器官,抽提基因组DNA。采用DNA点杂交方法检测5mC和5hmC在小鼠不同器官基因组中的含量变化,并利用DNA-特异性抗体免疫沉淀方法富集小鼠心脏,肝脏,肾脏,肺,脑皮质和小脑基因组中含5mC或5hmC的DNA片段,通过全基因组测序技术和生物信息学分析比较不同器官DNA甲基组和羟甲基组信息。结果：点杂交检测发现小鼠不同器官5hmC含量存在显著差异,与5mC含量无明显相关性。对六种小鼠器官基因组DNA5mC和5hmC的测序结果进一步印证了上述结论。分析5mC/5hmC在不同基因区域比例发现,5hmC多见于基因本体,5mC则大量分布于基因间区域。观察小鼠不同器官5mC或5hmC在基因本体区域的分布,5mC或5hmC的富集趋势无组织间差异。对小鼠肾脏及脑皮质基因启动子区和增强子区5mC和5hmC的分布分析进一步证明了两种DNA修饰分布特点的不同。结论：小鼠不同器官基因组DNA中5mC含量差异较小,但5hmC含量差异显著。小鼠不同器官基因组DNA中中5mC或5hmC在基因组特征性区域(启动子、基因本体区)的富集趋势类似,但富集程度存在差异。5hmC在全基因组范围的分布特点与5mC存在差异。目的：围术期肾脏缺血再灌注(IschemiaReperfusion,IR)损伤十分常见,可引起急性肾功能不全。已有研究发现脑IRI后DNA甲基化(5mC)水平明显增加,且与损伤预后密切相关,但尚无研究报道肾脏IR中DNA羟甲基化(5hmC)含量的变化和作用。因此,我们以小鼠IR肾脏为模型观察IR对基因组DNA中5mC和5hmC含量的影响,探索5hmC与IR中基因转录重编程的联系。方法：以雄性C57小鼠为研究对象,采用左侧肾动脉阻断40分钟恢复血供建立小鼠肾脏IR模型,右侧肾脏为对照。根据再灌注时间将小鼠分为再灌注4小时和24小时组(n=5)。于规定时间点处死小鼠留取肾脏组织行甲醛固定或液氮保存。组织切片HE染色及RT-qPCR检测IR特异性标志物确认建模效果。DNA点杂交及免疫组化检测5mC,5hmC含量。DNA-抗体免疫共沉淀联合qPCR检测特定基因位点5hmC变化,RT-QPCR检测这些基因及双加氧酶TET蛋白家族mRNA水平变化,分析5hmC含量变化的可能机制及其对基因表达调控可能产生的影响。结果：明确建模效果后,我们发现再灌注4小时组小鼠肾脏5mC,5hmC含量无明显变化,再灌注24小时组小鼠肾脏5mC含量不变但5hmC含量明显降低。检测特定基因位点5hmC含量后发现,IR肾脏中基因启动子区5hmC减少；同时这些基因mRNA水平增加。对TET蛋白家族成员mRNA水平的检测显示,IR引起Tet1和Tet2表达下调,Tet3未受影响。结论：IR影响小鼠肾脏的Tet1和Tet2表达,并引起基因组DNA5hmC含量减少。这些表观遗传修饰的变化很可能参与了IR的基因转录重编程。目的：近年来对IR损伤中表观遗传学变化及其作用的研究日趋增多,且均证实表观遗传调控与IR中的基因转录重编程存在紧密联系。我们在第二部分的研究中发现,小鼠肾脏IR会引起肾脏基因组5mC总量虽无变化,但5hmC总量减少,且对但基因位点5hmC的检测提示5hmC的变化与基因转录调控相关。在此基础上,我们观察了IR对小鼠肾脏基因组5mC,5hmC分布规律的变化,并结合小鼠肾脏IR基因表达谱数据进行5mC,5hmC的基因组学分析,研究5mC,5hmC与基因表达调控的相关性。方法：采用基因表达谱芯片检测对照与缺血再灌注后24小时小鼠肾脏组织的基因表达水平。通过DNA-抗体免疫沉淀方法分别富集含5mC或5hmC的DNA片段,利用全基因组测序技术获得对照组及IR组肾脏5mC和5hmC在全基因组范围的分布信息。利用MAT等生物信息学分析软件进行5mC,5hmC变化与基因表达变化的相关性分析。结果：IR引起小鼠肾脏基因转录的剧烈变化,并且随着再灌注时间的延长,IR引起的基因转录重编程影响范围逐渐扩大,基因表达谱变化与IR损伤的演变进程相一致。虽然IR会造成5hmC总量变化,但不会对5mC,5hmC在全基因组的分布规律产生影响。基因表达静态数据与测序数据的相关性分析提示,基因转录活跃基因转录起始位点附近5mC含量很低,而基因本体区域5hmC含量较高。分析IR引起的基因动态变化和特定基因区域5mC,5hmC含量的相关性发现,小鼠肾脏中基因本体区5hmC含量较高的基因更易受到IR的影响产生转录水平的变化,但未发现5mC含量与基因转录可塑性间的联系。结论：尽管IR伴随广泛的基因转录改变,但5mC或5hmC在全基因组的分布规律并没有显著改变；小鼠IR肾脏中,转录起始位点上游和基因本体区域5hmC含量较高的基因更易受到转录调控机制的影响。
【作者】黄凝；
【导师】薛张纲；
【作者基本信息】复旦大学，麻醉学，2013，博士
【关键词】小鼠；DNA甲基化；DNA羟甲基化；组织特异性；全基因组范围分析；小鼠肾脏；缺血再灌注；Tet2；

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