ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生的细胞和分子机制研究

【摘要】系统性红斑狼疮(SLE)是严重危害人类健康的自身免疫性疾病,好发于青年女性,可累及全身各个系统。SLE疾病的重要免疫学特征是自身抗体的产生,自身抗体不仅对疾病的诊断具有重要价值,在疾病发病中也有重要作用；其中,抗双链DNA抗体在疾病症状出现之前即可产生,是狼疮肾炎发生以及患者致死的主要原因,与SLE疾病的活动性密切相关,对疾病具有诊断和预后价值,是SLE疾病发生中的关键致病性抗体。然而,目前抗双链DNA抗体产生的机制仍不清楚。我们实验室前期研究发现,ALD-DNA,也称为自身免疫原性DNA,免疫同系小鼠可诱导以高水平抗双链DNA抗体为特征的狼疮样疾病,该小鼠模型为深入研究SLE发病机制提供了良好的实验平台。本研究拟以ALD-DNA诱导的狼疮小鼠模型和临床SLE患者为研究对象,探讨ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生的细胞和分子机制,旨在为进一步理解SLE疾病的发病机制和研发临床疾病诊疗新策略提供实验依据和理论基础。第一部分ALD-DNA可以诱导抗双链DNA抗体产生我们研究发现,ALD-DNA免疫同系小鼠能够有效诱导高水平的抗双链DNA抗体产生,并具有剂量依赖效应；进一步检测发现抗体以IgG为主,主要为IgGl,IgG2a和IgG2b;诱导的抗双链DNA抗体具有致病性,能够诱导明显的肾炎发生和高水平的尿蛋白产生。第二部分ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生依赖于CD4+T细胞1.T细胞对ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生是必需的为探讨ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生的细胞学机制,我们首先研究T细胞在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中的作用。用ALD-DNA免疫同系裸鼠,发现ALD-DNA不能在裸鼠中诱导高水平抗双链DNA抗体产生；在体外培养系统中发现,ALD-DNA能够体外刺激其免疫小鼠脾细胞产生抗双链DNA抗体,具有剂量和时间依赖效应；去除脾细胞中的T细胞导致抗双链DNA抗体显著下调,重新加入T细胞能够明显恢复抗双链DNA抗体的水平；体外培养只有加入T细胞才能介导ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生；用抗CD3抗体去除小鼠体内T细胞能够显著抑制ALD-DNA诱导的抗双链DNA抗体水平。以上结果提示T细胞对于ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生是必需的。2.ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生依赖于CD4+T细胞为探讨在抗双链DNA抗体产生中发挥重要作用的T细胞亚群,我们观察CD4+T细胞和CD8+T细胞的可能作用。通过体外培养系统发现,去除脾细胞中的CD4+T细胞导致抗双链DNA抗体明显下降,重新加入CD4+T细胞可以有效恢复抗双链DNA抗体的水平；而CD8+T细胞对ALD-DNA诱导抗体产生没有明显影响；与此相一致,体外培养只有加入CD4+T细胞才能介导ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生。为在体内验证这一现象,我们用特异性抗体清除小鼠体内CD4+细胞和CD8+细胞,结果显示,清除CD4+细胞导致ALD-DNA不能诱导高水平抗双链DNA抗体产生,而清除CD8+细胞无显著影响；将CD4+T细胞和CD8+T细胞转输裸鼠并用ALD-DNA免疫,发现CD4+T细胞转输可以介导抗双链DNA抗体产生,以IgGl,IgG2a和IgG2b为主,并导致了明显的蛋白尿和肾炎发生,而转输CD8+T细胞无明显效应。以上结果表明,ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生是依赖于CD4+T细胞的。第三部分Th17细胞及其亚群在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中至关重要1.IL-17在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中的重要作用基于CD4+T细胞在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中的关键作用,我们接下来探讨是什么样的T辅助细胞介导了抗体的产生。研究发现IL-17在SLE患者体内上调表达,并在狼疮小鼠的发病中具有重要作用；但IL-17是否参与抗双链DNA抗体的产生还不清楚。我们分析ALD-DNA免疫小鼠体内IL-17与抗双链DNA抗体的相关性,发现ALD-DNA免疫小鼠体内IL-17水平明显升高,并与抗双链DNA抗体水平密切相关,提示IL-17可能参与ALD-DNA诱导的抗双链DNA抗体产生；当通过表达IL-17的腺病毒载体上调小鼠体内IL-17的表达,发现可以明显提高ALD-DNA诱导的抗双链DNA抗体水平；当通过特异性阻断抗体阻断小鼠体内IL-17的功能,发现可以明显下调ALD-DNA诱导的抗双链DNA抗体水平,提示IL-17在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中有重要作用。我们用ALD-DNA免疫IL-17-/-小鼠和野生型小鼠,发现ALD-DNA能够在野生型小鼠中诱导高水平的抗双链DNA抗体产生,但不能在IL-17-/-小鼠中有效诱导抗双链DNA抗体产生,并且上调ALD-DNA的免疫剂量依然不能在IL-17-/-小鼠体内诱导高水平抗双链DNA抗体产生,说明IL-17在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中具有重要作用。我们同时发现,狼疮小鼠体内IL-17的水平与其肾炎严重程度和尿蛋白水平密切相关,上调小鼠体内IL-17水平导致更为明显的肾脏免疫荧光沉积、更严重的肾炎病理改变和更高的尿蛋白水平；阻断小鼠体内IL-17可以有效降低肾脏免疫荧光沉积、缓解肾炎的病理改变并降低尿蛋白水平；同样,ALD-DNA免疫野生型小鼠能够诱导明显的肾脏免疫荧光沉积,肾炎发生和蛋白尿,而免疫IL-17-/-小鼠不能诱导明显的肾脏免疫荧光沉积以及肾炎和蛋白尿的发生。2.Th17细胞在抗双链DNA抗体产生中有重要作用基于CD4+T细胞和IL-17在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中的重要作用,我们推测Th17细胞在抗双链DNA抗体产生中有重要作用。研究发现,ALD-DNA免疫小鼠体内Th17细胞比例明显上调,并与抗双链DNA抗体水平显著相关,转输Th17细胞能够有效上调ALD-DNA诱导的抗双链DNA抗体水平,而ALD-DNA不能在IL-17-/-小鼠中诱导高水平抗双链DNA抗体产生,提示Th17细胞在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中有重要作用。为探讨这一现象的临床意义,我们分析了31例新发SLE患者外周血Th17细胞比例和血清抗双链DNA抗体水平的关系,研究发现患者体内Th17细胞比例明显升高,与其抗双链DNA抗体、ESR和SLEDAI呈正相关,与血清C3水平呈负相关；通过随访发现,经过药物治疗疾病缓解后,Th17细胞比例明显降低,但其治疗前后的变化差值与抗双链DNA抗体、血清C3、ESR和SLEDAI的变化差值密切相关；以上研究提示Thl7细胞可能参与SLE患者抗双链DNA抗体的产生。3.Th17细胞可辅助B细胞产生抗双链DNA抗体为探讨Th17细胞在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中发挥重要功能的可能机制,我们研究Th17细胞的B细胞辅助功能。研究发现,ALD-DNA不能在裸鼠中有效诱导抗双链DNA抗体产生,而将Th17细胞转输裸鼠能够有效介导ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生,提示Thl7细胞能够辅助B细胞产生抗双链DNA抗体；进一步通过体外抗体诱导实验,发现Th17细胞在体外亦能够有效辅助B细胞产生抗双链DNA抗体。4.CCR6+CXCR5+Th17细胞具有B细胞辅助功能上述研究发现Th17细胞能够辅助B细胞产生抗双链DNA抗体,那么发挥B细胞辅助功能的Th17细胞亚群是什么?近年来大量研究用CCR6作为效应性T细胞分群的表面标志,我们前期研究发现CCR6+调节性T细胞在肿瘤免疫中发挥有效的免疫抑制功能；在此,我们分析CCR6在ALD-DNA免疫小鼠Th17细胞中的表达及其意义。研究发现CCR6表达在大多数的Th17细胞表面,CCR6-和CCR6+Th17细胞均表达高水平的RORγt;而与CCR6-Th17细胞相比,CCR6+Th17细胞表达相似水平的CD62L和CD69,但表达更高水平的CD44和CD45RO。进一步研究发现,CCR6+Th17细胞,而不是CCR6-Th17细胞,与ALD-DNA免疫小鼠体内抗双链DNA抗体水平密切相关,提示CCR6+Th17细胞可能参与ALD-DNA诱导的抗双链DNA抗体产生。我们通过抗体体外诱导系统和裸鼠体内转输实验发现,CCR6+Th17细胞能够在体外和裸鼠体内有效介导高水平抗双链DNA抗体的产生,而CCR6-Th17细胞的作用不明显。有研究报道CXCR5+Th17细胞是辅助性B细胞产生抗体的重要亚群,我们进一步将CCR6+Th17细胞分为CXCR5-和CXCR5+两个亚群,发现CCR6+CXCR5+Th17细胞与狼疮小鼠体内抗双链DNA抗体水平显著相关,并能够在体外和裸鼠体内辅助B细胞产生抗双链DNA抗体,而CCR6+CXCR5-Th17细胞未发现明显效应。为研究其临床意义,我们分析SLE患者体内CCR6+CXCR5+Th17细胞的比例及其与抗双链DNA抗体水平之间的关系；结果发现患者体内CCR6+CXCR5+Th17细胞的比例明显升高,并与患者抗双链DNA抗体水平和SLEDAI密切相关。以上研究表明,Th17细胞中的CCR6+CXCR5+亚群在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中具有重要的B细胞辅助作用。5.IL-17是CCR6+CXCR5+Th17细胞具有B细胞辅助功能的关键因素以上研究表明CCR6+CXCR5+Th17细胞具有辅助B细胞产生抗双链DNA抗体的功能,其可能机制是什么?基于IL-17在Th17细胞生物学功能中的重要性及其在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中的重要作用,我们探讨IL-17在CCR6+CXCR5+Th17细胞辅助B细胞产生抗体中的可能作用。研究发现,ALD-DNA刺激CCR6+CXCR5+Th17细胞能够有效诱导IL-17的分泌,在抗体体外诱导系统中加入IL-17阻断抗体可明显抑制抗双链DNA抗体的产生,通过特异性抗体阻断小鼠体内IL-17能够显著下调CCR6+CXCR5+Th17细胞介导的裸鼠体内抗双链DNA抗体产生；以上研究说明IL-17对于CCR6+CXCR5+Th17细胞辅助B细胞的功能具有重要作用。在临床患者体内,我们发现其血清IL-17的水平亦明显升高,并且与患者抗双链DNA抗体水平和SLEDAI密切相关。6.IL-17可通过IL-6-Stat3途径上调B细胞Bcl-6的表达以上研究表明,IL-17对于CCR6+CXCR5+Th17细胞的B细胞辅助功能具有重要作用,IL-17发挥作用的可能机制是什么呢?研究认为,生发中心B细胞的形成是产生IgG抗体的关键,而Bcl-6对生发中心B细胞的形成有重要作用,那么IL-17是否可以通过调节Bcl-6表达进而影响生发中心B细胞的形成呢?我们研究发现,ALD-DNA免疫的IL-17-/-小鼠,其生发中心B细胞的比例明显低于野生型小鼠,提示IL-17对生发中心B细胞的形成有重要影响；进一步研究发现,ALD-DNA免疫的IL-17-/-小鼠B细胞中,其Bcl-6表达水平显著低于野生型小鼠,提示IL-17对Bcl-6的表达有重要作用；通过体外直接用IL-17刺激ALD-DNA致敏的B细胞发现IL-17能够直接有效上调B细胞中Bcl-6的表达,具有剂量依赖效应；我们分选ALD-DNA免疫小鼠中表达IL-17受体的B细胞和不表达IL-17受体的B细胞,检测其Bcl-6的表达情况,结果发现Bcl-6在IL-17R-B细胞中的表达水平明显低于IL-17R+B细胞,提示IL-17能够直接作用于B细胞,提高其Bcl-6的表达水平。有研究报道JunD和Stat3是影响小鼠B细胞Bcl-6上调表达的重要分子,我们研究发现IL-17作用于B细胞对JunD的表达没有明显影响,但可以有效诱导Stat3的磷酸化；转染Stat3siRNA能够有效抑制IL-17诱导的Bcl-6上调表达,通过Stat3抑制剂也发现了一致结果,提示IL-17上调B细胞Bcl-6的表达是通过Stat3途径。有研究报道IL-17能够通过IL-6以正反馈的形式上调Stat3信号,我们发现IL-17刺激B细胞能够有效诱导IL-6的分泌,而IL-6阻断抗体可以有效抑制IL-17促进B细胞Bcl-6的表达,并下调Stat3的磷酸化水平。以上结果提示,IL-17可以通过上调B细胞Bcl-6的表达促进生发中心B细胞形成,而IL-6-Stat3途径在其中有重要作用。第四部分HMGB1在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体持续产生中极其关键我们前述研究探讨了ALD-DNA,又称自身免疫原性DNA,诱导抗双链DNA抗体产生的细胞和分子机制；然而,SLE是慢性自身免疫原性疾病,其重要特点不仅是高水平抗双链DNA抗体的产生,与此同样重要的是抗双链DNA抗体长时间维持高水平的状态,那么其在机体内的维持机制是什么?已有研究发现,SLE患者血浆中有大量的自身免疫原性DNA和抗双链DNA抗体形成的免疫复合物,该免疫复合物的沉积可以进一步激活补体系统,引起炎症反应,诱导组织损伤；免疫复合物也可以通过TLR9作用于树突状细胞产生I型干扰素,并在SLE发病中发挥作用。那么,免疫复合物在SLE患者体内是否可以诱导抗双链DNA抗体持续产生呢?1.ALD-DNA以免疫复合物的形式诱导抗双链DNA抗体持续产生我们研究发现,与正常人的血浆相比,SLE患者血浆可以有效刺激其PBMC产生抗双链DNA抗体,具有剂量依赖效应。为观察DNA成分的作用,我们用DNA酶预先处理患者血浆,发现能够显著下调患者血浆诱导的抗双链DNA抗体水平,提示DNA成分对于诱导抗体产生是必需的；而从患者血浆中分离的单独DNA成分不能有效诱导抗体的产生,提示蛋白成分对于患者血浆诱导抗体产生也是需要的；与此相一致,我们用蛋白酶K预处理患者血浆可以明显下调其诱导抗双链DNA抗体产生的能力；当用木瓜蛋白酶预处理患者血浆时,也能够下调诱导的抗双链DNA抗体水平,并具有剂量依赖效应；当同时用DNA酶和木瓜蛋白酶预处理患者血浆时,其诱导的抗双链DNA抗体水平有更明显的下降；我们分离患者血浆中的免疫复合物刺激其PBMC,发现免疫复合物能够有效诱导抗双链DNA抗体的产生,如果用DNA酶或者木瓜蛋白酶预处理,能够明显下调免疫复合物诱导的抗体水平。以上结果说明SLE患者体内ALD-DNA,即自身免疫原性DNA,不能单独诱导抗双链DNA抗体产生,而是以免疫复合物的形式有效诱导抗双链DNA抗体持续产生2.单纯DNA与抗体不足以有效诱导抗双链DNA抗体产生为探讨免疫复合物诱导抗双链DNA抗体产生的机制,我们将从患者血浆中分离DNA成分和免疫球蛋白成分,二者混合后刺激其PBMC,发现诱导的抗体水平显著低于直接分离的免疫复合物诱导的抗体水平,提示免疫复合物中的其它组分对抗双链DNA抗体的持续产生极其关键。3.HMGB1在免疫复合物诱导抗双链DNA抗体持续产生中有关键作用新近研究发现,HMGB1是SLE患者体内免疫复合物的组分之一,在免疫复合物诱导细胞因子产生中有重要作用,那么HMGB1是否参与免疫复合物诱导的抗双链DNA抗体产生呢?我们研究首先确证分离的免疫复合物中有HMGB1蛋白存在,进而用HMGB1阻断剂观察HMGB1的可能作用；结果发现,阻断HMGB1能够显著下调免疫复合物诱导的抗双链DNA抗体水平,具有剂量依赖效应；而加入外源HMGB1蛋白,能够明显上调免疫复合物诱导的抗双链DNA抗体水平,并增强分离的DNA和免疫球蛋白诱导抗双链DNA抗体产生的能力：另外,阻断HMGB1能够明显抑制患者血浆诱导的抗双链DNA抗体水平,并具有剂量依赖效应。以上结果表明,HMGB1在免疫复合物诱导抗双链DNA抗体产生中具有重要作用。为探讨其临床意义,我们分析了SLE患者免疫复合物中HMGB1的含量及其与抗双链DNA抗体水平的关系,结果发现患者免疫复合物中HMGB1的含量与其抗双链DNA抗体水平和SLEDAI呈显著正相关,提示患者体内HMGB1可能参与抗双链DNA抗体的产生。4.TLR2/MyD88信号介导HMGB1在抗双链DNA抗体持续产生中的关键作用上述研究说明HMGB1在抗双链DNA抗体产生中有关键作用,那么其机制是什么?我们通过特异性阻断剂分别阻断HMGB1的受体RAGE,TLR2和TLR4,结果发现RAGE阻断剂对诱导抗双链DNA抗体产生没有明显影响,而TLR2和TLR4阻断剂能够显著下调免疫复合物诱导的抗双链DNA抗体水平；进一步通过TLR2和TLR4的特异性阻断抗体发现,TLR2阻断抗体能够明显抑制诱导的抗双链DNA抗体水平,并具有剂量依赖效应；我们分别转染RAGE,TLR2和TLR4的siRNA,也发现了一致的结果；以上研究说明TLR2对HMGB1的识别在免疫复合物诱导抗体持续产生中有重要作用。与此结果相一致,当分别用MyD88和TRIF阻断剂时,发现MyD88阻断剂能够有效下调免疫复合物诱导的抗双链DNA抗体水平,而TRIF阻断剂无明显影响。我们加入外源HMGB1蛋白,发现其可以上调免疫复合物诱导的抗双链DNA抗体水平,而当同时应用TLR2阻断抗体或MyD88阻断剂时,发现二者可有效阻断抗双链DNA抗体的产生。以上结果表明,TLR2/MyD88信号对于HMGB1在抗双链DNA抗体产生中发挥重要作用是不可或缺的。5.HMGB1上调miR155的表达在抗双链DNA抗体持续产生中有重要作用近期研究发现,TLR的活化能够通过MyD88信号或TRIF信号上调miR155的表达,而miR155在B细胞产生抗体中有重要作用,那么miR155是否参与免疫复合物诱导的抗双链DNA抗体产生呢?我们研究发现,免疫复合物刺激其PBMC能够明显上调miR155的表达,加入外源HMGB1蛋白能够提高miRl55的表达水平,而HMGB1阻断剂或MyD88阻断剂均能够有效抑制这一效应,提不HMGB1可通过MyD88信号上调miR155的表达。那么,miR155在诱导抗双链DNA抗体产生中的作用是什么?结果发现,转染miR155inhibitor能够有效下调其表达水平,并有效抑制免疫复合物诱导抗双链DNA抗体产生,并阻断HMGB1蛋白对免疫复合物诱导抗体产生的增强效应；转染miR155mimics可有效上调其表达水平,明显上调免疫复合物诱导的抗双链DNA抗体水平,并进一步提高HMGB1对免疫复合物诱导抗体产生的增强作用。以上结果说明,HMGB1上调表达miR155在免疫复合物诱导抗双链DNA抗体持续产生中有重要作用。6.Ets-1是miRNA155的重要靶分子上述研究证明miRl55在免疫复合物诱导抗双链DNA抗体持续产生中有重要作用,那么miRNA155的靶分子是什么?我们通过筛选发现,免疫复合物刺激能够显著诱导Ets-1的下调表达,提示Ets-1可能是miR155的靶分子。当在免疫复合物刺激前转染miR155inhibitor时,发现转染组的Ets-1表达水平显著高于对照组,说明Ets-1是免疫复合物诱导抗双链DNA抗体持续产生中miR155的靶分子。基于已有研究证明miR155可以和Ets-1直接作用,我们继续探讨Ets-1在抗双链DNA抗体持续产生中的作用,发现转染Ets-1表达载体能够明显上调其表达水平,并显著抑制免疫复合物诱导的抗双链DNA抗体水平；转染Ets-1表达载体能够有效阻断miR155mimics在免疫复合物诱导抗双链DNA抗体产生中的作用,转染Ets-1siRNA能够明显阻断miR155inhibitor在免疫复合物诱导抗双链DNA抗体产生中的作用。以上结果表明,Ets-1是miRNA155在抗双链DNA抗体持续产生中的重要靶分子。7.临床患者miR155和Ets-1的表达水平及其与抗双链DNA抗体产生的关系为探讨上述结果的临床意义,我们分析SLE患者体内miR155和Ets-1的表达水平,及其与抗双链DNA抗体产生的关系。结果发现miR155在SLE患者的表达水平显著高于正常对照组,而Ets-1的表达水平明显降低；在SLE患者中,miR155的表达水平与其免疫复合物中HMGB1的含量呈正相关,与患者抗双链DNA抗体水平显著正相关；Ets-1的表达水平与miRNA155的表达呈负相关,与抗双链DNA抗体水平呈负相关。总结本研究,我们发现ALD-DNA自身免疫原性DNA)可以诱导抗双链DNA抗体产生,CD4+T细胞对ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生是不可或缺的；Th17细胞在ALD-DNA诱导抗双链DNA抗体产生中有重要作用,能够辅助B细胞产生抗双链DNA抗体,而其中CCR6+CXCR5+Th17细胞亚群才具有B细胞辅助功能；IL-17是CCR6+CXCR5+Th17细胞具有B细胞辅助功能的重要因素,IL-17可以通过IL-6-Stat3途径上调B细胞中Bcl-6的表达,进而促进生发中心B细胞的形成,促进抗体产生。抗双链DNA抗体产生后与自身免疫原性DNA(ALD-DNA)形成免疫复合物并可以诱导抗双链DNA抗体持续产生,而IMGB1可作为该免疫复合物的组分并通过TLR2/MyD88/miRNA155/Ets-1信号途径在免疫复合物诱导抗双链DNA抗体持续产生中具有关键作用。该研究首次发现Th17细胞及其亚群在抗双链DNA抗体产生的重要作用和机制,首次报道HMGB1在抗双链DNA抗体持续产生中的重要作用和机制,对深入理解抗双链DNA抗体的产生以及维持有重要意义,为进一步理解SLE的发病机制和研发临床诊疗新策略提供实验依据和理论基础。
【作者】温振科；
【导师】熊思东；
【作者基本信息】复旦大学，免疫学，2013，博士
【关键词】系统性红斑狼疮；ALD-DNA；抗双链DNA抗体；Th17细胞；HMGB1；

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